王興龍，蔡 強，桂文鋒，蔡增軒，許嬌嬌，任一平*

(1.浙江清華長三角研究院 分析測試中心，浙江 嘉興 314000；2.上海師范大學(xué) 環(huán)境與地理科學(xué)學(xué)院，上海 200233；3.浙江省疾病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310000)

赭曲霉毒素(Ochratoxin)是一類主要由曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)的真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，可分為赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)、赭曲霉毒素B(Ochratoxin B,OTB)和赭曲霉毒素C(Ochratoxin C,OTC)。其中OTA的毒性最強，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較長，可產(chǎn)生致畸[1]、致癌、腎毒性[2]、免疫毒性、肝細胞毒性[3]、神經(jīng)毒性[4]等毒性。由于受葡萄生長條件和釀制工藝的影響，葡萄酒易造成赭曲霉毒素的污染。近年來，Yusefi等[5]對伊朗的70個葡萄汁樣本進行評估研究，發(fā)現(xiàn)55.7%的樣本中OTA濃度高于0.125 μg/L，平均污染水平為0.5 μg/L，最高達2.6 μg/L。劉青等[6]對9個國家11種不同種類的葡萄酒中赭曲霉毒素進行篩查，OTA的檢出率高達45.4%，檢出濃度為1.1～11.5 μg/L，有4個樣本超過2 μg/L。為有效控制葡萄酒中OTA 對人類健康產(chǎn)生危害，國內(nèi)外相繼制定了限量標(biāo)準(zhǔn)，如我國GB 2761-2017標(biāo)準(zhǔn)[7]及歐盟法規(guī)[8]均規(guī)定OTA在葡萄酒中的最大殘留量為2 μg/kg。隨著葡萄酒中OTA風(fēng)險評估研究的深入，對其檢驗方法不僅要求結(jié)果更加精準(zhǔn)，而且要求前處理技術(shù)更加簡單、高效。

目前，酒類產(chǎn)品中真菌毒素的定量檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法[9]、高效液相色譜法[10-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]等。其中，酶聯(lián)免疫吸附法的前處理相對簡單，主要用于快速篩查，但易出現(xiàn)假陽性。高效液相色譜法的準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，但對前處理要求較高，抗干擾能力較差。而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、選擇性好、分析效率高等優(yōu)勢，逐漸成為赭曲霉毒素檢測的首選方法。目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測葡萄及其制品中真菌毒素的前處理技術(shù)主要有固相萃取柱凈化[14-15]、免疫親和柱凈化[5，16]、分散液-液微萃取[17-18]以及QuEChERS[19-20]等方法。然而，上述前處理技術(shù)成本較高，過程相對復(fù)雜，易造成目標(biāo)物損失，且無法滿足大批量樣本的同時檢測需求。

本研究將樣品直接稀釋、過濾膜處理，利用穩(wěn)定同位素稀釋技術(shù)消除基質(zhì)效應(yīng)，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測葡萄酒中OTA的方法。本方法簡單、高效、成本低，適用于大批量葡萄酒樣品中OTA的快速、準(zhǔn)確定量檢測，可為葡萄酒中OTA的安全風(fēng)險評估提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity H 超高效液相色譜儀、Waters TQD 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

OTA(C20H18ClNO6,CAS號：303-47-9)及其穩(wěn)定同位素13C20-OTA標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量濃度均為 10 μg/L，購自Romer國際貿(mào)易(北京)有限公司。色譜純乙腈、甲酸，以及0.22 μm親水PTFE針式濾膜購于上海安譜實驗科技股份有限公司;實驗用水為超純水，由Milli-Q超純水儀制備。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 OTA標(biāo)準(zhǔn)儲備液移取適量的OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用乙腈稀釋至10 mL，配制成100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃保存。

1.2.213C20-OTA工作溶液移取適量的13C20-OTA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用乙腈稀釋至5 mL，配制成5 μg/L的穩(wěn)定同位素工作溶液，于-20 ℃避光保存。

1.2.3 OTA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液準(zhǔn)確移取適量的OTA標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈-水-甲酸( 29.8∶70∶0.2，體積比)溶液逐級稀釋，分別配成0.05、0.1、0.2、0.5、1 μg/L的OTA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。移取20 μL13C20-OTA工作溶液與180 μL OTA 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于300 μL進樣小瓶中，充分混勻，待測。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確移取100 μL試樣于1.5 mL離心管中，加入900 μL乙腈-水-甲酸(29.8∶70∶0.2)溶液，渦旋混勻后，過0.22 μm PTFE針式濾膜。移取20 μL13C20-OTA工作溶液于300 μL進樣小瓶中，加入180 μL樣品濾液，充分混勻后，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件ACQUITY BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為40 ℃；進樣體積為10 μL；流速為0.3 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈。洗脫條件：0～1.0 min，70%A；1.0～4.5 min，70%～5%A；4.5～6.5 min，5%A；6.5～9.5 min，5%～70%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；毛細管電壓為3.0 kV；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃；脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔反吹氣流速為30 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)采集。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在ESI+模式下，采用MS Scan模式，對500 ng/mL的OTA及13C20-OTA分別進行一級質(zhì)譜全掃描分析，得到每種目標(biāo)物的母離子。比較不同錐孔電壓下母離子的響應(yīng)強度，以最大響應(yīng)值時為最佳錐孔電壓。采用Daughter模式，在不同碰撞能量下，對目標(biāo)物母離子分別進行二級質(zhì)譜全掃描，得到每種母離子的碎片離子，比較不同碰撞能量下碎片離子的響應(yīng)強度，選擇響應(yīng)強度較高的兩個子離子作為定量離子和定性離子，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。在上述優(yōu)化條件下，OTA及13C20-OTA的總離子流圖見圖1。

表1 OTA及其同位素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of OTA and its isotope

*quantitative ion

2.2 前處理條件的優(yōu)化

葡萄酒基質(zhì)相對復(fù)雜，含多種抗氧化劑、色素、葡萄糖與果糖等成分。在ESI+模式下，OTA及13C20-OTA的離子化效率易受到基質(zhì)干擾，從而影響定量檢測。本實驗按照下式評估基質(zhì)效應(yīng)：ME=|C-A|/B×100%[21]，式中，C為樣品加標(biāo)1 μg/L測定的峰面積，A為樣品本底的峰面積，B為OTA濃度為1 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。若ME=100%，說明無基質(zhì)效應(yīng)；ME>100%，說明存在基質(zhì)增強效應(yīng)；ME<100%，說明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。將葡萄酒樣品經(jīng)乙腈-水-甲酸(29.8∶70∶0.2)溶液分別稀釋5、10、20倍后按照本方法進行分析，結(jié)果顯示，3種稀釋倍數(shù)下的基質(zhì)效應(yīng)均接近100%，說明直接稀釋可基本消除基質(zhì)效應(yīng)。綜合考慮方法靈敏度與儀器污染，本實驗將稀釋倍數(shù)設(shè)為10倍，同時加入穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)[22- 23]，以降低質(zhì)譜儀器波動的影響，保證實驗結(jié)果更加可靠。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限在優(yōu)化條件下，采用內(nèi)標(biāo)法對質(zhì)量濃度為0.05～1 μg/L的OTA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，以O(shè)TA與13C20-OTA的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，OTA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，μg/L)進行線性擬合。結(jié)果表明，13C20-OTA的質(zhì)量濃度為 0.5 μg/L時，OTA在0.05～1 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=18.264 5X+0.105 421，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 6。在空白樣品中加入一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，按本方法進行前處理后進樣分析，得到OTA的檢出限(LOD，S/N≥3)和定量下限(LOQ，S/N≥10)分別為0.1、0.3 μg/L。

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度針對紅葡萄酒和白葡萄酒2種空白樣品進行1.00、2.00、5.00 μg/L 3個水平的加標(biāo)回收實驗，每個加標(biāo)水平測定6 次，通過內(nèi)標(biāo)法計算加標(biāo)回收率，并計算同一濃度水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，作為日內(nèi)精密度。按照以上操作連續(xù)測定3 d，以每天對應(yīng)濃度的平均值計算RSD，作為日間精密度。結(jié)果如表2所示，OTA的回收率為102%～113%，日內(nèi)、日間的RSD均小于10%，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 OTA的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of OTA

2.4 方法比較

為驗證本方法的可行性，以空白葡萄酒為基質(zhì)，OTA的加標(biāo)濃度設(shè)為 2 μg/L，參考GB 5009.96-2016[24]第三法，采用免疫親和柱凈化法與本實驗建立的直接稀釋法，在相同的分析條件下進行測定，比較加標(biāo)回收結(jié)果是否存在顯著性差異，結(jié)果如表3所示。經(jīng)計算，t值為0.71，小于t(0.05,10)=2.23，說明兩種前處理方法的結(jié)果一致。

2.5 實際樣品檢測

通過市場采購，選取橡木桶、白楊河、長城、威龍、香格里拉、天然、赤霞珠、梅洛等國產(chǎn)品牌的15種紅葡萄酒和5種白葡萄酒，采用本方法進行檢測。結(jié)果顯示，所有樣本中均未檢出OTA，表明上述樣品滿足歐盟和我國食品安全標(biāo)準(zhǔn)對于葡萄酒中OTA的限量要求。

3 結(jié) 論

本文建立了葡萄酒中OTA的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，通過直接稀釋的前處理方法，并結(jié)合穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)定量技術(shù)，避免了目標(biāo)物損失，保證了測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。本方法前處理簡單、高效、靈敏度高、成本低，適合大批量葡萄酒中OTA的快速、準(zhǔn)確定量檢測，同時還可用于葡萄酒中多種真菌毒素的檢測。