周 琨 陸 霽 殷曉星 董 冰 徐 晗 李龍至 馬保金

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040; 2上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院普外科 上海 200040)

胃癌是常見的惡性腫瘤,是癌癥死亡的第二大原因。隨著診斷技術(shù)和治療手段的進(jìn)步,胃癌的死亡人數(shù)在一定程度上有所下降,但仍是威脅人類生命健康的嚴(yán)重疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國每年胃癌新發(fā)病例中,大多數(shù)患者處于胃癌晚期,5年生存率不足20%[2]。因此,尋找胃癌早期診斷和治療方法,是提高生存率的關(guān)鍵。胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等過程相當(dāng)復(fù)雜,涉及到癌基因,抑癌基因和非編碼基因等,而非編碼基因現(xiàn)已經(jīng)被逐步認(rèn)識,并在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[3]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼RNA家族,長度為20～22個核苷酸不等,并且發(fā)現(xiàn)其參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程,包括細(xì)胞增殖,分化,遷移和凋亡等,其參考腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)過程備受關(guān)注[4-5]。miR-128在腫瘤中的表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。我們通過研究miRNA-128a和miRNA-128b在胃癌組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其可作為早期診斷和預(yù)后的指標(biāo),現(xiàn)報告如下。

資料和方法

臨床資料選擇2015年1月至2017年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院就診且經(jīng)病理確診的胃癌患者118例,為胃癌組。其中男性75例,女性43例,年齡45～79歲,平均(61.56±13.54)歲。根據(jù)美國癌癥聯(lián)盟委員會(AJCC)第七版胃癌腫瘤TNM分期:Ⅰ期21例,Ⅱ期26例,Ⅲ期60例,Ⅳ期11例;根據(jù)分化程度分為低分化81例,中、高分化37例。納入標(biāo)準(zhǔn):均經(jīng)胃鏡檢查,并活檢確證為胃癌;均知情同意,簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他腫瘤;有免疫性疾病或者血液性疾病;合并肝炎,結(jié)核和肺部感染等感染性疾病;不能耐受手術(shù)、圍手術(shù)期死亡或者不愿意接受隨訪;術(shù)前采取化療和放療等措施;臨床資料不完整。選擇同期在我院病理診斷為胃息肉的患者75例,為胃息肉組,男性48例,女性27例,年齡45～79歲,平均(61.86±11.38)歲。另外選擇同期在我院行健康體檢者45例,為健康對照組,男性27例,女性18例,年齡45～79歲,平均(60.67±15.37)歲。3組年齡、性別等一般資料匹配。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

血液標(biāo)本的抽取患者入院及手術(shù)后2周取清晨空腹肘靜脈血約10 mL,在4 ℃的條件下放置30 min,低速離心20 min (1 800 r/min,r=15 cm),去上清液,將其放置于-70 ℃冰箱中保存。

qRT-PCR檢測根據(jù)GenBank中的miRNA-128a、miRNA-128b和U6的序列號,并用Premier Primer5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。miRNA-128a引物序列,上游:5’-ACACTCCAGCTGGGTCACAGT-GAACCG-3’,下游:5’-CCCAAGCTTATGAAGC-CAAATGATGCAAAAT-3’;miRNA-128b引物序列,上游:5’-TGTTCTTAAGGCTAGGGAACCA-3’,下游:5’-CCGGAATTCCGGCCGTCAGGCAG-TCTTCAGC-3’;U6引物序列,上游:5’-CTCGCT-TCGGCAGCACA-3’,下游:5’-AACGCTTCACG-AATTTGCGT-3’。反向引物為試劑盒自帶。qRT-PCR的總反應(yīng)體系為25 μL,包括上下游引物各1.0 μL(其濃度為10 μmmol/L),cDNA為0.8 μL,RNaseH2O為12.2 μL和SYBRPPrimix Ex TaqTM10 mL。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 10 min,95 ℃ 5 s和60 ℃ 60 s,共40個循環(huán)。在60 ℃下用ABI7700軟件收集熒光信號進(jìn)行溶解曲線分析,每個樣品進(jìn)行3個平行復(fù)孔,采用絕對定量法進(jìn)行測定,用1 mol/L的人工合成miRNA分別稀釋成濃度106、105、104、103和102fmol/L作為標(biāo)準(zhǔn)品,以濃度對數(shù)為X軸,以對應(yīng)的Ct值為Y軸,繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出miRNA-128a和miRNA-128b的絕對含量。

觀察指標(biāo)比較胃癌組與健康對照組血清miRNA-128a和miRNA-128b水平的變化及術(shù)前術(shù)后的變化,胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b水平與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系,及其在診斷早期胃癌的靈敏度和特異性。

結(jié) 果

各組血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)的變化從表1可知,胃癌組血清miRNA-128a表達(dá)水平明顯高于胃息肉組(q=26.388,P<0.01)和健康對照組(q=32.195,P<0.01),手術(shù)后較術(shù)前明顯降低(t=14.321,P<0.01),胃息肉組明顯高于健康對照組(q=7.198,P<0.01);而胃癌組血清miRNA-128b表達(dá)水平明顯低于胃息肉組(q=211.148,P<0.01)和健康對照組(q=249.984,P<0.01),手術(shù)后較術(shù)前明顯升高(t=15.139,P<0.01),胃息肉組明顯低于健康對照組(q=38.232,P<0.01)。

表1 各組血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)的變化Tab 1 Changes of serum miRNA-128a and miRNA-128b expression in each group

血清miRNA-128a和miRNA-128b診斷胃癌的效能從表2和圖1可知,血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)水平對診斷胃癌具有較高的靈敏度和特異性,兩指標(biāo)進(jìn)行二元回歸得方程Y=0.078*XmiRNA-128a-0.042*XmiRNA-128b+2.294,聯(lián)合檢測的靈敏度為78.8%,特異性為97.3%,曲線下面積明顯高于單個指標(biāo)miRNA-128a(Z=3.436,P<0.01)和miRNA-128b(Z=2.658,P<0.01),而miRNA-128a和miRNA-128b之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 血清miRNA-128a和miRNA-128b診斷胃癌的效能比較Tab 2 Efficacy of serum miRNA-128a and miRNA-128b expression in the diagnosis of gastric cancer

圖1 血清miRNA-128a和miRNA-128b診斷胃癌的ROC曲線Fig 1 ROC curve of serum miRNA-128a and miRNA-128b expression in the diagnosis of gastric cancer

胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b與臨床指標(biāo)的關(guān)系從表3可知胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)水平與性別、年齡和腫瘤直徑無明顯相關(guān)性,而與腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度具有顯著相關(guān)性(P<0.01)。

血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)水平與2年內(nèi)存活率的關(guān)系胃癌患者術(shù)后隨訪2年,19例出現(xiàn)死亡,為死亡組;99例存活,為存活組。從表4可知胃癌存活組血清miRNA-128a表達(dá)水平明顯低于死亡組(P<0.01),而存活組的血清miRNA-128b水平明顯高于死亡組(P<0.01)。

表4 隨訪2年出現(xiàn)死亡的胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)Tab 4 Expression levels of serum miRNA-128a and miRNA-128bin patients with gastric cancer within 2 years’ follow-up

血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)水平預(yù)測2年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能從表5和圖2可知胃癌患者血清miRNA-128a水平>98.47 fmol/L,其預(yù)測2年內(nèi)出現(xiàn)死亡的靈敏度為89.5%,特異性為81.8%,曲線面積為0.889;而當(dāng)血清miRNA-128b≤94.86 fmol/L,預(yù)測2年內(nèi)死亡的靈敏度為94.7%,特異性為81.8%,曲線下面積為0.931;兩者聯(lián)合檢測與單個指標(biāo)檢測比較并不能提高預(yù)測2年內(nèi)死亡的診斷效能。

表5 血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)在預(yù)測2年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能比較Tab 5 Efficacy of serum miRNA-128a and miRNA-128b expression levels in predicting death within 2 years’ follow-up

圖2 血清miRNA-128a和miRNA-128b水平在預(yù)測2年內(nèi)出現(xiàn)死亡的ROC曲線Fig 2 ROC curves of serum miRNA-128a and miRNA-128b expression levels in predicting death within 2 years’ follow-up

早期胃癌的預(yù)后較好,晚期胃癌往往出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差,因此早期診斷是提高胃癌預(yù)后的關(guān)鍵。但是胃癌早期癥狀不典型,很難被察覺,胃鏡能夠提高確診率,但對臨床醫(yī)師和觀察技巧均有一定的要求。胃鏡下活檢是一種侵入性手段,存在取樣誤差,從而影響疾病的診斷。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步和腫瘤機(jī)制研究的深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA可能成為新型基因水平的診斷標(biāo)記物,為胃癌的診斷帶來了新的希望[6-8]。組織標(biāo)本中的miRNA為腫瘤診斷提供了精確的手段,但取組織標(biāo)本具有侵入性,一定程度上限制其成為普遍、易獲取的腫瘤標(biāo)記物。血清標(biāo)本易獲得,可以重復(fù)獲取且穩(wěn)定性較好,miRNA在室溫下放置24 h,在冷凍、煮沸的條件下表現(xiàn)穩(wěn)定,甚至在極酸和極堿的條件下仍然穩(wěn)定[9-10]。miR-128在腫瘤中表達(dá)的缺失與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切聯(lián)系,現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)miR-128在前列腺癌[11]、結(jié)腸癌[12]和乳腺癌[13]等實(shí)體腫瘤出現(xiàn)表達(dá)下調(diào),類似發(fā)揮抑癌基因的作用,而在另一些腫瘤如骨肉瘤等[14]中存在高表達(dá),說明miR-128在不同的腫瘤中具有不同的功能,這或與miR-128不同的分型有關(guān)。

本研究顯示胃癌組血清miRNA-128a表達(dá)水平明顯高于對照組,手術(shù)后較術(shù)前明顯降低;而胃癌組血清miRNA-128b表達(dá)水平明顯低于健康對照組,手術(shù)后較術(shù)前明顯升高,說明兩者均參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程,miRNA-128a作為促癌基因,miRNA-128b作為抑癌基因,是否存在某種平衡需進(jìn)一步研究。為進(jìn)一步驗(yàn)證血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)水平能否成為胃癌早期診斷的指標(biāo),本研究發(fā)現(xiàn)血清miRNA-128a>76.68 fmol/L時,其靈敏度為71.2%,特異性為97.8%,曲線下面積為0.884,同樣具有較高的診斷效能,其特異性較好。血清miRNA-128b≤204.12 fmol/L時,其靈敏度為96.6%,特異性為68.9%,曲線下面積為0.901,具有較高的診斷效能,其靈敏度較好。故我們將兩指標(biāo)進(jìn)行二元回歸得聯(lián)合檢測指標(biāo),其靈敏度為93.3%,特異性為81.4%,曲線下面積0.943,診斷效能明顯提高,在靈敏度和特異性均得到平衡。與文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA-128b可能成為診斷胃癌的腫瘤指標(biāo)相一致[15]。而目前尚未發(fā)現(xiàn)聯(lián)合血清miRNA-128a和miRNA-128b檢測診斷胃癌的相關(guān)報道。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)水平與性別、年齡和腫瘤直徑無明顯相關(guān)性,而與腫瘤細(xì)胞分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度顯著相關(guān),說明miRNA-128a和miRNA-128b與胃癌的惡性程度具有一定的聯(lián)系?，F(xiàn)已知miRNA-128a能夠明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖,在白血病中促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,敲除miRNA-128a后其增殖作用明顯降低,說明其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用。而一些文獻(xiàn)報道轉(zhuǎn)染miRNA-128a到神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi),能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖、浸潤和遷移等,并且抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為,說明miRNA-128a在不同細(xì)胞系具有不同生物學(xué)作用?，F(xiàn)已知miRNA-128b在胃癌細(xì)胞中為低表達(dá),與抑制胃癌細(xì)胞增殖、浸潤和凋亡作用相一致,并發(fā)現(xiàn)其通過激活A(yù)kt/NF-κB信號通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖[16]。在急性淋巴細(xì)胞白血病中miRNA-128b出現(xiàn)低表達(dá),并且其表達(dá)水平的高低是評價療效的重要指標(biāo)[17]。本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌存活組血清miRNA-128a表達(dá)水平明顯低于死亡組,而存活組的血清miRNA-128b水平明顯高于死亡組,說明胃癌血清miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)水平與胃癌患者2年內(nèi)是否存活具有一定的聯(lián)系。通過ROC曲線分析,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA-128a和miRNA-128b表達(dá)水平在預(yù)測2年內(nèi)存活率具有較高的靈敏度和特異性,但是聯(lián)合檢測并不能提高單個指標(biāo)預(yù)測2年內(nèi)是否出現(xiàn)死亡的效能。因此,對于預(yù)測2年內(nèi)可能出現(xiàn)死亡的胃癌患者,采取更多的干預(yù)手段,延長胃癌患者的生存期,具有重要的臨床價值。

總之,聯(lián)合檢測血清miRNA-128a和miRNA-128b有助于胃癌診斷,對2年內(nèi)存活率預(yù)測具有重要參考價值。