鮑永毅，陳 曉，牛明福，李夢圓，付應建，劉瑞文，鄭少亭

1河南科技大學食品與生物工程學院 微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，洛陽 471023；2國家獸用藥品工程技術研究中心，洛陽 471003

內生菌(endophyte)是指生活在健康的植物組織或細胞內且不會引起宿主植物明顯感染癥狀的一類微生物群[1]。植物內生菌與宿主植物長期共存[2]，不會改變植物的表型特征和功能，可形成穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)[3]。內生菌具有數量眾多、種群結構多樣的特點，是潛力巨大的微生物新資源[4]，還可產生與宿主植物相同或相似的活性成分[5]。內生菌的研究對于保護野生與瀕危藥用植物、拓展藥用資源、新藥研發(fā)等均有重要意義。茵陳(Artemisiacapillaris)，也被稱為因塵、綿茵陳、白蒿等，其地上部分是傳統(tǒng)中藥[6]，具清熱利濕、利膽退黃之功效，為治黃疸要藥，且可預防流感，治中暑、感冒、水腫等癥。植物茵陳中含有多種化學成分，包括香豆素類、黃酮類、色原酮類、有機酸類、烯炔類、三萜類、甾體類和醛酮類等[7]。茵陳多為野生，其采收較麻煩且受季節(jié)限制，研究茵陳內生菌并研究其活性產物與茵陳成分的相關性，對于拓展茵陳藥用范圍和新藥發(fā)現具有重要意義[8]。對一些內生細菌發(fā)酵產物研究，發(fā)現發(fā)酵液中的一種或幾種成分具有抗菌作用(含細菌與真菌)，有研究表明， 80%的植物內生真菌在抗真菌、抗藻類或抗雜草方面具有活性，而來自土壤的真菌中只有大約43%具有活性[9]。近些年來，已從各種中草藥中分離到了大量的內生菌，但茵陳內生菌的研究較少，且內生細菌的分離鑒定還未見有報道。本研究為了解茵陳內生細菌的組成和種類，并從中篩選產茵陳相同或相似抑菌活性物質的內生菌，為利用微生物發(fā)酵生產藥物提供資源。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 實驗材料

新鮮完整植株茵陳采摘于河南省洛陽市南郊外龍門山，經河南科技大學林學院許曉利老師鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基

因不同內生細菌對營養(yǎng)的要求各異，本試驗選用以下7種培養(yǎng)基進行內生細菌的分離，LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂20，pH7.0。KMB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，無水氯化鎂1.4，無水硫酸鉀10，瓊脂15，甘油10，pH7.2。PDA培養(yǎng)基(g/L)：土豆 200，葡萄糖 20，瓊脂20，自然pH值。營養(yǎng)瓊脂(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂20，pH7.2。YPD培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10，蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂20，pH7.2。TSA培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白胰酶消化物15，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5，NaCl 5，瓊脂20， pH7.2。BPA培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3，蛋白胨5，葡萄糖 10，酵母粉1，瓊脂20，pH7.2。純化及菌種的保藏仍使用相應的分離培養(yǎng)基。

1.1.3 測試菌

腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和產腸毒大腸埃希氏菌(enterotoxigenicEscherichiacoli)為本實驗室保存。

1.2 內生細菌的分離與純化

將采集到的茵陳根莖葉流水沖洗后，先于75%乙醇溶液中浸泡3 min，無菌水沖洗3次，然后在0.1% HgCl2溶液中漂洗3 min，無菌水沖洗4次。茵陳樣品置于無菌研缽中，加入適量無菌水研磨至漿狀，梯度稀釋，分別涂布于上述7種固體培養(yǎng)基上，最后一次沖洗后的無菌水也涂布平板作為對照，37 ℃培養(yǎng)3～4天，無菌水對照應無菌長出，挑選梯度稀釋的平板上的不同單菌落平板劃線純化。

1.3 菌落觀察與鏡檢

觀察各種培養(yǎng)基分離到的菌落形態(tài)，并進行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 分子生物學鑒定

采用細菌基因組DNA小量提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)提取純化菌株的基因組DNA。以16S rDNA通用引物27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′和1492R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′進行PCR擴增，擴增體系(50 μL)為：2×Taq PCR Mix 25 μL，去離子水19 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，基因組DNA模版2 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司測序，序列結果提交GenBank，使用DNAStar中的Megalign進行同源性分析，通過BLAST程序在GenBank上進行相似性序列檢索分析，并利用DNAStar7.1軟件的MegAlign程序構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 內生細菌發(fā)酵液的抑菌活性測定

將52株內生細菌分別接種于不同培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)72 h，離心收集上清液，96孔板法測定對S.enteritidis、S.aureus和enterotoxigenicE.coli的抑菌活性，具體方法如下：在96孔板中分別加入發(fā)酵上清液100 μL，用PBS倍比稀釋三個梯度，每個梯度三個重復，然后每孔中加入活化的測試菌(106個/mL)各100 μL，同時用恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)做陽性對照，培養(yǎng)基做陰性對照，37 ℃培養(yǎng)12 h，酶標儀測定OD600。抑制率計算公式為(OD陰性對照-OD陽性對照或樣品)/OD陰性對照×100%，結果判定標準為：抑制率為75～100%判定為“++++”， 抑制率為50%～75%判定為“+++”， 抑制率為25%～50%判定為“++”， 抑制率為0～25%判定為“+”。

1.6 內生細菌發(fā)酵液的成分初步分析

參照中藥茵陳的化學成分，分別以沒食子酸、蘆丁、咖啡酸和齊墩果酸作為標準品，利用分光光度法測定抑菌活性較強的菌株發(fā)酵液成分，具體測定方法參照文獻[10-13]。

1.7 內生細菌發(fā)酵液的成分初步測定

1.7.1 發(fā)酵液上清處理

發(fā)酵液上清處理方法參照文獻[14]進行，具體方法如下：用無菌吸管吸取10 mL的發(fā)酵液12 000 rpm離心10 min，收集上清液。取上清液1 mL與9 mL色譜純甲醇混勻沉淀24 h，再12 000 rpm離心10 min，上清液0.22 μm濾膜過濾作為高效液相色譜的測試液。

1.7.2 HPLC 色譜條件及檢測方法

準確稱取沒食子酸、蘆丁、咖啡酸和齊墩果酸各種標品5 mg 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，用抽濾器和微孔濾膜過濾，作為標準品母液。然后各取0.1 mL 標準品母液混合均勻后加入2.2 mL 甲醇配成20 g/L 的混合標準品溶液。

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax ODS-C18(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流速為1.0 mL /min;柱溫為室溫(30 ℃) ；進樣量10 μL。流動相和檢測波長分別為：沒食子酸流動相甲醇∶0.1%磷酸=10∶90；檢測波長為280 nm。蘆丁流動相甲醇∶0.1%磷酸=85∶15；檢測波長為390 nm?？Х人崃鲃酉嗉状肌?.1%磷酸=20∶80；檢測波長為323 nm。齊墩果酸流動相甲醇∶0.1%磷酸=85∶15；檢測波長為210 nm。

圖1 9種茵陳內生細菌的鏡檢形態(tài)圖(1 000×)Fig.1 Microscopic morphology of nine endophytic bacterial strains of Artemisia capillaris(1 000×) 注： A 枯草芽孢桿菌(NA-1)；B 簡單芽孢桿菌(NA-5)；C 短小芽孢桿菌(NA-6)；D蠟樣芽孢桿菌(LB-8)；E 巨大芽孢桿菌(TSA-18)；F 病研所芽孢桿菌(LB-11)；G 地衣芽孢桿菌(BPA-29)；H 屎腸球菌(LB-13)；I 醋酸鈣不動桿菌(KMB-32)。Note:A B.subtilis (NA-1);B B.simplex (NA-5);C B.pumilus (NA-6);D B.cereus (LB-8);E B.megaterium (TSA-18);F B.idriensis (LB-11);G B.licheniformis (BPA-29);H Enterococ- cus faecium (LB-13);I Acinetobacter calcoaceticus (KMB-32).

2 結果與分析

2.1 內生菌的分離純化

對初步分離到的細菌進行劃線分離純化，經菌落形態(tài)和鏡檢觀察后，共獲得85株內生菌，其中從NA培養(yǎng)基中篩選到10株菌；從LB培養(yǎng)基中篩選到25株菌；從TSA培養(yǎng)基中篩選到5株菌；從BPA培養(yǎng)基中篩選到19株菌，從KMB培養(yǎng)基中篩選到16株菌；從YPM培養(yǎng)基中篩選到6株菌；從PDA培養(yǎng)基中篩選到4株菌。

對上述85株菌又進行多次分離純化并進行鏡檢分類，最終確定得到52株內生細菌。其中NA培養(yǎng)基6株，LB培養(yǎng)基17株，TSA培養(yǎng)基6株，BPA培養(yǎng)基8株，KMB培養(yǎng)基8株，YPM培養(yǎng)基5株， PDA培養(yǎng)基2株，對這52株內生細菌進行編號處理并進行下一步的鑒定。

2.2 菌體形態(tài)觀察

52株內生細菌革蘭氏染色觀察有51株為陽性菌，多為桿狀，只有LB13為球形；另1株KMB32革蘭氏染色為陰性，為長細桿狀，具體形態(tài)見圖1。

2.3 同源性分析

內生細菌的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均在約1 500 bp處出現條帶，部分PCR條帶見圖2。

圖2 內生細菌PCR產物電泳圖Fig.2 PCR amplification from the endophytic bacteria 注：M：DL2 000 DNA 分子量 ；1～10：茵陳內生細菌菌株(部分)16S rDNA PCR擴增產物。Note:M:DL2 000 DNA Marker;1～10:PCR amplification of 16S rDNA from the endophytic bacteria (partly).

將52株菌的16S rDNA序列上傳NCBI GenBank數據庫，登錄號見表2。根據16S rDNA 分類標準，對52株內生細菌進行同源性分析，可分為6組，同源率在99%以上的有4組，同源率在95%～99%之間的有1組，同源性在95%以下的有1組，結果見表1。

表1 分離菌株序列分析統(tǒng)計結果Table 1 Results of sequence analysis of isolated strains

2.4 系統(tǒng)進化分析

根據同源性分析結果，在同源率99%以上的4組分離菌中各選幾株代表(7株：NA-1、NA-2、KMB-31、KMB-34、LB-7、BPA-22和TSA-20)，同源率99%以下的分離菌(8株：LB-3、KMB-32、BPA-29、NA-5、LB-11、LB-12、LB-13、LB-16)與GenBank公布的序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。NA-1、NA-2、KMB-31和KMB-34與枯草芽孢桿菌親緣關系較近；LB-16、 BPA-29、LB-12和LB-3與地衣芽孢桿菌親緣關系較近；TSA-20與短小芽孢桿菌親緣關系較近；LB-11與病研所芽孢桿菌親緣關系較近；LB-2、LB-1和BPA-22與蠟狀芽孢桿菌親緣關系較近；LB-7與巨大芽孢桿菌親緣關系較近；NA-5與簡單芽孢桿菌親緣關系較近；LB-13與屎腸球菌親緣關系較近；KMB-32與醋酸鈣不動桿菌親緣關系較近。

NCBI BLAST比對分析結果表明LB-13為屎腸球菌，KMB-32為醋酸鈣不動桿菌，其他50株菌為芽孢桿菌，與2.2的革蘭氏染色鏡檢結果相吻合，結果見表2。

圖3 茵陳內生細菌系統(tǒng)發(fā)育樹構建Fig.3 Phylogenetic tree construction of Artemisia capillaris endophytic bacteria

2.5 內生細菌發(fā)酵液抑菌活性測定結果

52株內生細菌發(fā)酵液對3種指示菌的抑菌結果見表3，其中17株菌對這3種指示菌均有不同程度的抑菌效果，另35株菌對3種指示菌未檢測到抑菌活性。

表2 從茵陳中分離的52株內生細菌菌株編號、GenBank登錄號及菌株分類Table 2 The strain numbers,GenBank numbers and classification of the 52 endophytic bacteria strains isolated from Artemisia capillaris

續(xù)表2(Continued Tab.2)

菌株編號No.GenBank登錄號GenBank acession No. 菌株名稱Strain nameBPA-28MH187618枯草芽孢桿菌B.subtilisBPA-29MH187617地衣芽孢桿菌B.licheniformisKMB-30MH187616枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-31MH187615枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-32MH187651醋酸鈣不動桿菌Acinetobacter calcoaceticusKMB-33MH187650枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-34MH187614枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-35MH187613枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisKMB-36MH187612枯草芽孢桿菌B.subtilisKMB-37MH187611枯草芽孢桿菌B.subtilisYPM-40MH187608枯草芽孢桿菌B.subtilisYPM-41MH187607巨大芽孢桿菌B.megateriumYPM-42MH187606枯草芽孢桿菌B.subtilisYPM-43MH187605枯草芽孢桿菌B.subtilisYPM-44MH187604枯草芽孢桿菌B.subtilisPDA-48MH187640巨大芽孢桿菌B.megateriumPDA-49MH187639枯草芽孢桿菌B.subtilis

表3 17株內生細菌對3種指示菌的抑菌效果Table 3 The antibacterial activity of the 17 strains of endophytic bacteria against the 3 indicator bacteria

2.6 內生細菌發(fā)酵液的成分初步測定

對抑菌活性為“+++”的菌株NA-3、BPA-24和KMB-32發(fā)酵液進行分光光度法測定，結果見表4、表5。

表4 4 個化合物標準品的線性回歸方程及線性范圍(n=3)Table 4 4 Linear regression equations with linear ranges for 4 compounds (n=3)

表5 三個菌株發(fā)酵液中化合物含量Table 5 Compound contents in the fermented liquid of three strains

2.7 HPLC 色譜結果

標準品沒食子酸、蘆丁、咖啡酸和齊墩果酸的出峰時間分別在8.406、5.794、26.724和23.084 min，相同條件下，3個菌株的發(fā)酵液在沒食子酸、蘆丁和咖啡酸相應的出峰時間均未出現相應的峰，齊墩果酸相同時間點有峰出現，色譜圖見圖4，從出峰時間可以推測3個菌株發(fā)酵液中可能含有齊墩果酸。

3 討論

藥用植物是篩選天然藥用成分的主要原料之一，但從藥用植物中直接提取獲得藥用成分的工藝復雜，含量低，且藥用植物易受地理環(huán)境及時令的限制[15]。通過培養(yǎng)藥用植物內生菌來生產藥用活性成分不僅可以突破植物生長周期長、產量低、不可再生等限制，同時也可以為內生菌大規(guī)模發(fā)酵生產藥用活性物質開辟新途徑[16]。

茵陳素有“二月茵陳，五月蒿”的說法，茵陳一年只有春季和秋季兩個采收期，種植周期長，采摘麻煩，分離茵陳內生菌進行茵陳藥用成分的發(fā)酵生產不失為一種理想方法，而查閱文獻僅見左飛[17]進行了茵陳放線菌的分離與抗楊樹褐斑病的活性研究，其他未見有相關報道。本研究對茵陳內生細菌進行分離純化，最終得到52株內生細菌，有50株為不同種類的芽孢桿菌，1株醋酸鈣不動桿菌，1株屎腸球菌，可以看出茵陳內生細菌中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌，這與從其他藥用植物中分離出的內生細菌多為芽孢桿菌是一致的[18-20]。但本實驗初步分離純化的85株內生細菌中革蘭氏陰性菌有18株，革蘭氏陽性菌有67株，最終分離純化后僅剩下了1株革蘭氏陰性菌，考慮與分離純化過程中人為操作有關，也有文獻報道[21]有些內生菌不適合體外多次傳代培養(yǎng)，推測在純化過程中丟失。

圖4 齊墩果酸的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC Chromatogram of oleanolic acid 注：A :齊墩果酸標準品；B、C和D分別為菌株NA-3，BPA-24和KMB-32發(fā)酵液上清。Note:A:standard of Gallate;B，C and D are fermentation liquid supernatants of strains NA-3,BPA-24 and KMB- 32,respectively.

Chen等[22]報道植物內生細菌中未培養(yǎng)微生物占很大比例，培養(yǎng)方法分析的細菌僅限于那些能夠在人工培養(yǎng)基上生長的細菌，一些適合于分離培養(yǎng)基營養(yǎng)條件的菌株在分離過程中大量富集，而不適合于分離培養(yǎng)基營養(yǎng)條件的菌株在分離過程中逐漸衰退。許多研究已經證實，通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法鑒定的微生物僅占環(huán)境微生物總數的0.1%～10%[23]，應用高通量測序技術能更準確反映植物內生微生物的種類組成和真實比例，但微生物發(fā)酵生產活性物質需要可持續(xù)培養(yǎng)的微生物，所以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法仍是內生菌分離的主要方法。

本研究對分離培養(yǎng)的內生細菌發(fā)酵液進行初步抑菌活性測定，篩選到17株能產生抑菌活性物質的內生細菌，為下一步內生菌產生活性物質的研究奠定了基礎。其中對抑菌活性較強的三個菌株發(fā)酵，發(fā)酵液進行分光光度法和高效液相色譜分析，發(fā)現發(fā)酵液中含有齊墩果酸，且菌株NA-3和KMB-32發(fā)酵液中齊墩果酸含量較高，為直接發(fā)酵生產齊墩果酸提供了素材。雖然分光光度法測定發(fā)酵液中含有酚類和黃酮類，但液相色譜未測到沒食子酸和蘆丁，推測可能是發(fā)酵液中含有其他的酚類和黃酮類物質，下一步將進一步對發(fā)酵液進行分離分析，確定發(fā)酵液中的成分及發(fā)揮抑菌活性的具體成分。