郁平 姬小凡 王敏 徐曉艷

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(ICP)是妊娠期常見病，也是誘發(fā)胎兒窘迫、早產(chǎn)的重要原因，部分孕婦可能造成死胎等嚴(yán)重后果。ICP發(fā)生后肝臟正常代謝功能紊亂，近年來(lái)報(bào)道顯示，信號(hào)通路作用失調(diào)是ICP后引起肝功能異常的重要環(huán)節(jié)[1]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原蛋白激酶家族的重要成員，可介導(dǎo)肝內(nèi)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。覃春美等[2]認(rèn)為JNK異常激活可誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，并影響肝內(nèi)膽汁代謝。本研究建立ICP動(dòng)物模型，分析JNK與ICP的關(guān)系，旨在進(jìn)一步探討ICP發(fā)病機(jī)制，為臨床干預(yù)提供借鑒。

資料與方法

一、一般資料

實(shí)驗(yàn)大鼠均由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，納入40只清潔級(jí)SD雌性大鼠和10只雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，體質(zhì)量(220.78±14.92)g，鼠齡(165.15±20.39)d；以充足飼料和清水常規(guī)喂養(yǎng)，在發(fā)情期將雌性和雄性大鼠按4∶1比例同籠喂養(yǎng)。觀察陰栓脫落情況，以陰栓脫落為妊娠成功。至妊娠第15 d，隨機(jī)將40只雌性大鼠分為觀察組和對(duì)照組，每組20只。觀察組體質(zhì)量(225.76±18.23)g；鼠齡(174.47±16.79)d。對(duì)照組體質(zhì)量(227.05±17.70)g；鼠齡(176.98±15.56)d。兩組大鼠體質(zhì)量、鼠齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。

二、ICP建模

觀察組大鼠在常規(guī)喂養(yǎng)基礎(chǔ)上，自妊娠第15 d開始，自大鼠后肢皮下注射孕酮(國(guó)藥準(zhǔn)字H31021265，上海通用藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格1 mL∶0.25 g已酸羥孕酮，5 mg戊酸雌二醇)，75 mg/(kg·d)，同時(shí)注射α乙炔雌二醇(美國(guó)Sijma公司提供，貨號(hào)：1260001，以1 mL精油配伍0.2 mg α乙炔雌二醇比例備制待用)，1.25 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥干預(yù)5 d。對(duì)照組大鼠繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)。兩組大鼠均在妊娠后第3周取眶靜脈取血1 mL，處死大鼠，取肝組織標(biāo)本。

三、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

(一)血清總膽紅素(TBil)檢測(cè) 將眶靜脈血1 mL，3 000 r/min離心10min，取上清液，采用全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè)血清TBil水平。HD-F2600型生化分析儀由濟(jì)南漢方醫(yī)療器械有限公司提供。

(二)免疫印跡法 檢測(cè)磷酸化JNK：取50 mg大鼠肝組織，研磨后置入EP管中進(jìn)行裂解，離心15 min后取上清液備用，取10 μL冷凍，室溫下解凍，PBS液溶解稀釋20倍，余上清液與5倍樣品緩沖液混合，按40 mL/管分裝，加熱變性5 min后冷卻備用。每孔加入200 μL工作液，混勻后37 ℃下孵育30 min，取微孔板，在550 nm下測(cè)量吸光度，計(jì)算蛋白濃度。

(三)免疫組化法 檢測(cè)大鼠肝組織JNK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：取大鼠肝臟石蠟標(biāo)本，一次進(jìn)行脫蠟、梯度水化及抗原修復(fù)處理，完成后漂洗，用5%BSA封閉液室溫封存標(biāo)本1 h，去封閉液，以1∶50稀釋一抗抗體，滴入標(biāo)本組織，4 ℃孵育過夜。去一抗液，漂洗，取切片，甩盡TBST液，滴加顯色液DAB工作液50 μL，室溫孵育15 min，觀察標(biāo)本顏色，結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比和染色結(jié)果計(jì)分乘積評(píng)估結(jié)果，以得分≥4分為結(jié)果陽(yáng)性[3]。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，無(wú)(0分)、<50%(1分)、50%～75%(2分)及>75%(3分)；染色結(jié)果，無(wú)(0分)、淺黃色(1分)、黃色(2分)及棕黃色(3分)。

四、觀察指標(biāo)

記錄兩組大鼠TBil、JNK信號(hào)通路蛋白表達(dá)量及JNK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，比較兩組大鼠TBil水平、JNK信號(hào)通路及JNK陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

五、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組TBil和JNK

觀察組大鼠血清TBil和肝組織中JNK蛋白表達(dá)量分別為(8.94±2.58)μmol/L和1.57±0.48，對(duì)照組分別為(6.19±2.14)μmol/L和1.16±0.63，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為3.669和2.315；P值分別為0.001和0.026)。40只雌性大鼠TBil與JNK蛋白表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(r=0.455，P=0.000)。見圖1。

圖1 TBil與JNK蛋白表達(dá)量線性關(guān)系分析

二、兩組免疫組化結(jié)果比較

觀察組大鼠JNK陽(yáng)性者15只，占75%，對(duì)照組JNK陽(yáng)性者7只，占35%。兩組小鼠JNK細(xì)胞陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.465，P=0.011)。

A：JNK陰性；B：JNK陽(yáng)性

圖2大鼠肝組織JNK免疫組化染色結(jié)果(DAB200)

討 論

JNK屬促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員，既往報(bào)道顯示，JNK存在3個(gè)不同編碼基因，其中JNK1和JNK2在各種組織中廣泛存在，并通過c-Jun、ATF2及p53等下游底物發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。JNK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)主要依賴于MAPK激酶的識(shí)別和支架蛋白組合信號(hào)復(fù)合物[4]，從而介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)因子的代謝凋亡。傅應(yīng)亞等[5]研究發(fā)現(xiàn)，JNK信號(hào)通路可直接調(diào)控胞質(zhì)內(nèi)Bim和Bcl-2等靶蛋白的活性，是肝臟損傷重要的調(diào)控因子。ICP患者以肝細(xì)胞和膽小管的色素沉著為主要病理表現(xiàn)，隨著膽汁淤積的加重，逐漸發(fā)生肝組織損傷。膽汁淤積是JNK信號(hào)通路磷酸化重要的刺激因素，目前認(rèn)為信號(hào)通路激活與功能蛋白表達(dá)相關(guān)[6]，本研究分析ICP大鼠模型TBil與JNK蛋白表達(dá)量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者具有正相關(guān)性，提示JNK的異常激活可能增加TBil水平，進(jìn)而影響膽汁淤積癥患者肝功能狀態(tài)。另外，本研究還對(duì)比了兩組大鼠模型肝組織中JNK表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陳秋玲等[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，JNK抑制劑有助于調(diào)節(jié)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平，進(jìn)而改善膽汁淤積程度，說(shuō)明JNK參與ICP過程，糾正JNK信號(hào)通路異?？赡苡兄诟纳婆R床癥狀。

目前，臨床對(duì)JNK信號(hào)通路與ICP的關(guān)系尚未完全闡明，Vucur 等[8]一項(xiàng)報(bào)道認(rèn)為，JKN異?？赡苁歉谓M織代償性增殖作用障礙的原因之一，影響肝臟自我修復(fù)功能，使肝功能持續(xù)降低，進(jìn)而導(dǎo)致TBil異常升高，膽汁淤積。同時(shí)膽汁酸可激活TGR5膽汁酸受體，抑制JNK和Caspase復(fù)合物的形成，并上調(diào)死亡受體5表達(dá)水平，誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷和肝纖維化進(jìn)程，因而推測(cè)JNK信號(hào)通路異常與膽汁酸可能存在相互作用關(guān)系，使ICP持續(xù)進(jìn)展。ICP孕婦胎盤微絨毛數(shù)量減少，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互融合而成束狀，滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生固縮，這些變化使胎盤物質(zhì)交換效能降低，成為膽汁淤積的誘因。而JNK不僅參與肝細(xì)胞增殖分化，而且對(duì)細(xì)胞形態(tài)和骨架的維持具有調(diào)控作用，Dada等[9]認(rèn)為JNK同源重組基因敲除會(huì)使其上游調(diào)節(jié)分子缺失，并加快病程進(jìn)展，這也說(shuō)明JNK信號(hào)通路在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因而，對(duì)于ICP患者，JNK信號(hào)通路的正常調(diào)控有助于改善膽汁酸代謝，緩解膽汁淤積狀態(tài)。另外，JNK還可能與Smad、ERK等其他信號(hào)通路相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，起到加強(qiáng)調(diào)控的作用，這有待于今后進(jìn)一步深入研究。