林 海,蔡怡清,李 冰,2,董穎博,2,李 陽

1 北京科技大學(xué)能源與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100083 2 工業(yè)典型污染物資源化處理北京市重點實驗室,北京 100083

我國工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展,使得河流等水體普遍受到了不同程度的污染,水體受到污染后, 河道水流緩慢導(dǎo)致水中污染物部分沉積或通過吸附作用在底泥中富集,長期累積下使得底泥成為內(nèi)源污染源,而底泥中微生物可以通過同化或異化作用對污染物進(jìn)行降解[1]。另外,由于微生物對外界水環(huán)境變化較為敏感,河流水環(huán)境質(zhì)量的變化可使底泥微生物在豐度和群落結(jié)構(gòu)上發(fā)生一定的改變,在微生物作為環(huán)境現(xiàn)狀指示生物的同時,河流底泥微生物可以反過來影響外界水環(huán)境,從而使得河流水體生態(tài)修復(fù)成為可能,因此研究其群落結(jié)構(gòu)特征具有重要意義。目前高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于研究環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及進(jìn)化關(guān)系[2],國內(nèi)外學(xué)者也越來越關(guān)注河流微生物群落結(jié)構(gòu)與水質(zhì)的響應(yīng)關(guān)系[3- 5]。

媯水河為延慶的母親河,是官廳水庫三大入庫河系之一。針對媯水河冬季水流動性差、水體富營養(yǎng)化較為嚴(yán)重的問題,本文采用MiSeq高通量測序方法研究了媯水河不同斷面底泥微生物群落結(jié)構(gòu)分布特征,分析底泥微生物群落與環(huán)境因子之間的關(guān)系,研究結(jié)果對媯水河水生態(tài)環(huán)境保護(hù)和水質(zhì)管理提供數(shù)據(jù)支撐及理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣品采集

媯水河流域分布在北京市延慶城區(qū)內(nèi),屬于永定河水系,是北京市重要的供水水源河道和水源保護(hù)區(qū),地理坐標(biāo)為115°49′21″E—116°16′16.75″E,40°24′52.18″ N—40°33′25.91″N,發(fā)源于延慶城區(qū)東北13公里處,橫貫延慶盆地,在下屯鄉(xiāng)大路村北入官廳水庫后入永定河,沿途有支流古城河、三里河和蔡家河匯入,河長18.5 km,流域面積1064.66 km2,占延慶區(qū)總面積的52%。媯水河流域?qū)俅箨懠撅L(fēng)氣候區(qū),冬季寒冷干燥,在農(nóng)場橡膠壩至南關(guān)橋段間水體流動性差,河岸及淺灘區(qū)水生植物稀少且分布不均,水體富營養(yǎng)化較為嚴(yán)重,為官廳水庫水環(huán)境改善帶來了沉重的負(fù)擔(dān),也極大的影響了延慶城區(qū)周邊的生態(tài)環(huán)境[6]。

根據(jù)《水質(zhì) 采樣方案設(shè)計技術(shù)規(guī)定》(HJ 495- 2009)的斷面設(shè)置原則在媯水河干流設(shè)置9個斷面(D1—D9),古城河(DG)、三里河(DS)、蔡家河(DC)三個支流分別各設(shè)置1個斷面,共12個,如圖1。于2017年11月采用多點混合采樣法對每個斷面進(jìn)行采樣,每個斷面設(shè)置距離為10 m的3個采樣點,每個采樣點設(shè)置3—5個重復(fù)。使用有機(jī)玻璃采水器采集36個采樣點上覆水樣500 mL,利用便攜式柱狀采泥器采集河流表層底泥(0—10 cm),底泥樣品在去除雜物后,將各斷面樣品分別各自混合,用無菌袋封裝并4℃冷藏運送至實驗室,放入-80℃冰柜保存至DNA提取。

圖1 采樣點位置示意圖Fig.1 Sampling sites in Guishui RiverD表示采樣樣品編號,各采樣點地理位置如下：D1(N40°30′57″, E116°7′34″); D2(N40°30′54″, E116°7′5″); DG(N40°29′37″, E116°5′8″); D3(N40°29′1″, E116°4′16″); D4(N40°27′42″, E116°2′34″); D5(N40°27′38″, E116°0′3″); D6(N40°27′21″, E115°58′55″); D7(N40°27′5″, E115°58′42″); DS(N40°27′7″, E115°57′54″); D8(N40°28′20″, E115°57′55″); DC(N40°27′52″, E115°53′1″); D9(N40°26′42″, E115°50′28″)

1.2 樣品理化分析

底泥樣品經(jīng)冷凍干燥后研磨,稱取0.1 g樣品于50 mL比色管中,加入25 mL堿性過硫酸鉀溶液,在0.15—0.16 MPa壓力下保持120—124℃的溫度30 min,自然冷卻后過濾,濾液定容到100 mL,總氮采用紫外分光光度法、總磷采用鉬酸銨分光光度法測定[8]。氨氮和硝態(tài)氮按照《HJ 634- 2012 土壤氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的測定氯化鉀溶液提取-分光光度法》國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定,并取1 g粉末原樣用2 mL的1 mol/L鹽酸超聲波3 h除去無機(jī)碳后,用德國Elemantar vario EL cube元素分析儀進(jìn)行總TOC/TN的測定[9]。

1.3 DNA的提取及高通量測定

根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進(jìn)行總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量,PCR擴(kuò)增及其高通量測序采用細(xì)菌引物為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′。擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3 min,27個循環(huán)(95℃變性30 s,55℃退火30 s, 72℃延伸30 s),最后72℃延伸 10 min。所有樣本反應(yīng)結(jié)束后,每個樣本3個重復(fù),將同一樣本的PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進(jìn)行純化,Tris-HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST (Promega, USA) 進(jìn)行檢測定量。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序,測序委托北京中科晶云科技有限公司進(jìn)行,對原始序列進(jìn)行預(yù)處理,根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類,選取高質(zhì)量的序列進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

高通量測序所得的序列通過QIIME進(jìn)行處理,主要包括OUT分類、多樣性分析和PCoA聚類分析；采用CANOCO 4.5進(jìn)行線性回歸的冗余分析(RDA)分析,獲取底泥微生物群落對環(huán)境因子之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 底泥及上覆水的理化性質(zhì)分析

表1 媯水河水體各項理化指標(biāo)

表2 媯水河表層底泥各項理化指標(biāo)

2.2 優(yōu)勢微生物菌群分布

利用Miseq測序技術(shù)研究媯水河底泥微生物群落結(jié)構(gòu),共檢出70門228綱1168屬,其中豐度最大的10個菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae),如圖2所示。以上菌門之和在各個樣品中均占84% 以上,但這些菌門的分布有所不同。變形菌門(Proteobacteria)在各個樣品中均是第一優(yōu)勢門,而在豐度上也存在差異,其中D7樣品最高,占69.1%,而D5樣品相對較低,占45.3%。

圖2 媯水河底泥樣品主要優(yōu)勢菌門群落結(jié)構(gòu)組成比例Fig.2 Relative abundance of the most abundance classes at phylum level in the analyzed samplesBacteroidetes:擬桿菌門；Proteobacteria:變形菌門；Acidobacteria:酸桿菌門；Chloroflexi:綠彎菌門；Actinobacteria:放線菌門；Firmicutes:厚壁菌門；Chlorobi:綠菌門；Verrucomicrobia:疣微菌門；Cyanobacteria:藍(lán)細(xì)菌門；Nitrospirae:硝化螺旋菌門；Others:其他

對12個底泥樣品的變形菌門微生物的分布特征進(jìn)行分析,結(jié)果見表3?？梢钥闯?β-變形菌綱(β-proteobacteria)和δ-變形菌綱(δ-proteobacteria)是變形菌門豐度最大的兩個菌群,β-變形菌綱約占細(xì)菌總量的11.01%—31.50%,δ-變形菌綱約占細(xì)菌總量的11.6%—20.24%,除此之外,γ-變形菌綱(γ-proteobacteria)和α-變形菌綱(α-Proteobacteria)也占有較高的豐度比例,而ε-變形菌綱(ε-proteobacteria)的豐度最低。DC樣品中α-變形菌綱(α-proteobacteria)含量偏高,達(dá)到12.8%。

表3 媯水河底泥樣品中變形菌門微生物的分布比例/%

從屬水平上對微生物的占比情況進(jìn)行統(tǒng)計,其中相對豐度大于1%的包括20個屬(平均豐度),如圖3所示,分別是Bacteroidales_norank、Sinobacteraceae_norank、脫氯單胞菌屬(Dechloromonas)、Comamonadaceae_norank、Ellin6067_norank、地桿菌屬(Geobacter)、Stramenopiles_norank、iii1- 15_norank、SC-I- 84_norank、MND1_norank、Syntrophobacteraceae_norank、Myxococcales_norank、硫桿菌屬(Thiobacillus)、Dok59、Ignavibacteriaceae_norank、Betaproteobacteria_norank、Gemm- 1_norank、Syntrophaceae_norank、Deltaproteobacteria_norank、Xanthomona-daceae_norank。其中,脫氮單孢菌屬、Comamonadaceae_norank、SC-I- 84_norank、硫桿狀菌屬、Ellin6067_norank、Dok59、MND1_norank均隸屬于β-變形菌綱。

圖3 媯水河底泥樣品主要優(yōu)勢菌屬群落結(jié)構(gòu)組成比例Fig.3 Relative abundance of the most abundance classes at genus level in the analyzed samplesBacteroidales_norank:未命名；Sinobacteraceae_norank：未命名；Dechloromonas：脫氮單孢菌屬；Comamonadaceae_norank：未命名；Ellin6067_norank：未命名；Geobacter：地桿菌屬；Stramenopiles_norank：未命名；iii1- 15_norank：未命名； SC-I- 84_norank：未命名；MND1_norank：未命名；Syntrophobacteraceae_norank：未命名；Myxococcales_norank：未命名； Thiobacillus：硫桿狀菌屬；Ignavibacteriaceae_norank：未命名； Betaproteobacteria_norank：未命名；Gemm- 1_norank:未命名；Syntrophaceae_norank：未命名；Deltaproteobacteria_norank：未命名；Xanthomona-daceae_norank：未命名

不同斷面樣品的優(yōu)勢種屬有所差別。其中DG、D5的優(yōu)勢菌屬為Bacteroidales_norank,D3、D6的優(yōu)勢菌屬集中在Sinobacteraceae_norank,D4、D7含有較高比例的脫氮單孢菌屬微生物,但上游點位D1、D2和下游點位DS、D8、DC、D9的優(yōu)勢菌屬比較分散,分別為BPC076_norank、Comamonadaceae_norank、Dok59、硫桿狀菌屬、iii1- 15_norank、MND1_norank。

2.3 微生物群落多樣性及差異性分析

如表4所示,本研究將相似度為97%的序列劃分為1個OTU,并進(jìn)行多樣性指數(shù)計算。由Ace豐富度指數(shù)可知,D7樣品的豐富度較其他樣品偏低,低至2673,而DG古城河樣品的Ace指數(shù)最高,達(dá)4869,D5樣品其次,為4826,表明DG、D5樣品中物種總數(shù)也相對最高,Chao豐富度指數(shù)所表現(xiàn)趨勢和Ace指數(shù)相同。各樣品Shannon指數(shù)均大于6.0,其中DC蔡家河樣品的Shannon指數(shù)值最高,為8.72,其多樣性相對較高,D1、D2、D3、D6、D7點Shannon指數(shù)均小于8.0,其中D7點最小,為6.56。

為了進(jìn)一步分析樣本間在群落物種組成上的差異性,基于weighted Unifrac[12]采用PCoA分析衡量樣本間群落物種組成的相似度,結(jié)果表明12個樣品主要分布在兩個不同的位置。如圖4所示PC1是造成樣品差異性最大的主坐標(biāo)成分,解釋度為35.08%,其次為PC2,解釋度為25.83%,對物種分布的總解釋量為60.91%。在PC1和PC2維度上,將采樣地分為兩組,媯水河中游點位D2、D3、D4、D6、D7、D8和DS微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較高為一組,上游點位D1、DG及下游點位D9、DC相似度較高為一組,進(jìn)而將兩個分組的Shannon指數(shù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果也表明兩組多樣性存在顯著性差異(P=0.037) 。

表4 底泥微生物群落豐富度和多樣性指數(shù)

圖4 基于Weighted Unifrac的PCoA分析Fig.4 PCoA plot based on Weighted Unifrac PC1：第一主分量 First primary coordinate；PC2：第二主分量 Second primary coordinate

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子關(guān)系的冗余分析

圖5 微生物群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子的RDA分析Fig.5 RDA analysis of environmental factors and microbial community structureRDA:冗余分析 Redundancy analysis； DO：溶解氧 Dissolved oxygen；T：溫度 氨氮 Ammonia 硝態(tài)氮 Nitrate；TN：總氮 Total nitrogen；TP：總磷 Total phosphorus；C/N：碳氮比 Carbon to nitrogen ratio

3 討論

3.1 媯水河不同斷面微生物群落結(jié)構(gòu)特征

媯水河第一優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria),在水環(huán)境中普遍存在。相關(guān)研究表明其在濕地、養(yǎng)殖廢水和深海沉積物等環(huán)境中均以第一優(yōu)勢門存在[13-15],大多數(shù)在生物脫氮、生物除磷及諸多污染物降解過程中起重要作用的微生物均歸屬于變形菌門[16]。在綱水平上,β-變形菌綱占比最多,達(dá)到11.01%—31.50%,其廣泛存在河流和湖泊中(如松花江[17]、海寧長山河[18]、東江[19]、Prealpine湖[20]等),并在氮磷等污染物的去除中起到了重要的作用[21]。

媯水河各樣品Shannon多樣性指數(shù)均較高,與微生物多樣性指數(shù)在水體底泥表層通常最高有關(guān)[22]。D7點Shannon多樣性指數(shù)較其他點位低,而D7點變形菌門豐度最高,經(jīng)實地調(diào)研這可能是由于D7點位河面較寬,水流速極小(小于0.02 m3/s),微生物遷移速度慢導(dǎo)致菌種單一穩(wěn)定,多樣性小。媯水河微生物群落結(jié)構(gòu)在12個樣品間存在斷面差異,媯水河中游點位D2、D3、D4、D6、D7、D8和DS微生物群落結(jié)構(gòu)相似度較高,這與中游點位均分布在延慶城區(qū)內(nèi),受人類活動影響大有關(guān)。下游D9入官廳水庫點位和支流DC蔡家河點位差異性較小,與兩個點位地理位置相近、附近環(huán)境相似有關(guān),而在三條支流中古城河DG點和蔡家河DC點具有一定的相似性,是由于兩條支流附近均有村莊分布,與城區(qū)有一定距離,受農(nóng)業(yè)面源污染影響大,因此生態(tài)環(huán)境相似度高,微生物群落結(jié)構(gòu)差異性較小。

3.2 媯水河微生物群落生態(tài)功能及對環(huán)境因子的相關(guān)性

底泥微生物群落結(jié)構(gòu)會隨著環(huán)境因子的變化呈現(xiàn)出一定的空間分布特征,而微生物群落結(jié)構(gòu)的變化又會在一定程度上反映環(huán)境因子的變化情況[3]。王娜等[23]在研究太湖沉積物中微生物生物量與碳、氧、磷等主要元素關(guān)系時發(fā)現(xiàn),太湖沉積物TOC/TN的變化顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu)。鮑林林等[24]通過高通量測序研究得出氨氮是影響河流底泥氨氮化微生物群落結(jié)構(gòu)特征的主要因子,與本研究結(jié)論一致。劉吉文等[25]在研究典型海域微生物群落結(jié)構(gòu)中得出DO對細(xì)菌屬水平上具有重要顯著影響,本研究中Bacteroidales-norank與DO呈正相關(guān),而Bacteroidales-norank多存在與生物糞便內(nèi),常被作為糞便來源標(biāo)識物[26],作為DG、D5點的優(yōu)勢菌屬,與DG點農(nóng)村動物糞便、D5點城區(qū)生活污水排放相關(guān)。DC蔡家河點位優(yōu)勢菌屬iii1- 15_norank隸屬于酸桿菌門(Acidobacteria),與pH相關(guān)性最大,并呈正相關(guān),這與酸桿菌是生長較緩慢的寡營養(yǎng)菌,其豐度受pH影響較大相符,且pH對不同亞群相關(guān)性影響不同[27],有研究表明氮肥會降低酸桿菌細(xì)菌的豐度[28],本研究中iii1- 15_norank與pH正相關(guān),這可能與施肥導(dǎo)致pH下降有關(guān)[29]。

4 結(jié)論

(1)媯水河中下游水質(zhì)偏差,上覆水中營養(yǎng)物質(zhì)對底泥污染存在一定的影響,基本呈正相關(guān)性；支流三里河水質(zhì)和底泥污染較嚴(yán)重,對媯水河干流水質(zhì)影響較大,因此,要進(jìn)一步加大對支流水源的監(jiān)督與控制。

(2)媯水河底泥微生物共檢出70門228綱1168屬,作為第一優(yōu)勢菌門,變形菌門(Proteobacteria)在各樣品中占比高達(dá)45.3%—69.1%,其中β-變形菌綱(β-proteobacteria)和δ-變形菌綱(δ-proteobacteria)是變形菌門豐度最大的兩個菌群,占比分別為11.01%—31.50%和 11.6%—20.24%；媯水河底泥微生物群落豐度總體較高,多樣性也相對較高,但不同樣品之間存在差異性,其中世園段D7點Ace豐富度指數(shù)和Shannon多樣性指數(shù)均較其他點位低。

致謝：感謝羅明科、李陽、王源在野外采樣中給予的幫助。