徐 達，梅漫莉，徐慶陽,2,*，陳 寧,2

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457）

L-纈氨酸是人體所必需的8 種氨基酸之一，屬于分支鏈氨基酸，是合成各類抗體、激素以及酶等的原料，在人體內(nèi)有特殊的生理功能，是維持人生命活動的重要物質[1]。目前，L-纈氨酸在自然環(huán)境中主要以蛋白質組成成分的形式存在，但是游離的L-纈氨酸在自然界中并不多見，因此，獲取L-纈氨酸的途徑主要有化學合成法、提取法以及微生物發(fā)酵法[2]。隨著對L-纈氨酸研究的深入，具有原料成本低、反應條件溫和及可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點的微生物發(fā)酵法逐漸成為世界范圍內(nèi)生產(chǎn)L-纈氨酸的主要方式，而發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的成本則主要受到發(fā)酵水平高低的影響[3-5]。發(fā)酵水平的高低在發(fā)酵生產(chǎn)的上、中、下游都有不同的體現(xiàn)：發(fā)酵生產(chǎn)上游的菌種改造[6-9]、發(fā)酵生產(chǎn)中游的過程控制[10-12]以及發(fā)酵生產(chǎn)下游的分離提取[13-15]都關乎發(fā)酵生產(chǎn)的最終產(chǎn)量。目前，L-纈氨酸主要利用經(jīng)代謝工程手段改造之后的谷氨酸棒狀桿菌進行發(fā)酵生產(chǎn)，而這種方法目前主要面臨糖酸轉化率不高、主產(chǎn)物積累造成反饋抑制以及副產(chǎn)物丙氨酸中后期積累過多影響最終L-纈氨酸提取的問題[16]。

生物素又稱VH、VB7和輔酶R，以多種方式參與谷氨酸棒狀桿菌的生長代謝，包括丙酮酸脫羧反應，合成吡啶、核苷酸、核酸，形成嘌呤核嘧啶的堿基以及合成脂肪酸、蛋白質和聚糖等。生物素[17-18]是整個生物界生長發(fā)育所必需的元素，在使用谷氨酸棒狀桿菌作為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸時，生物素添加量直接影響生產(chǎn)菌的生長、增殖和代謝速率，并決定細胞轉型的時間及細胞膜的通透性，添加適量的生物素能夠使產(chǎn)酸高峰期提前，延長產(chǎn)酸周期，從而提高L-纈氨酸的產(chǎn)率，因此，確定一個合適的生物素添加量是提高L-纈氨酸產(chǎn)率的有效手段。

本研究著重探究生物素添加量，提高L-纈氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量以及糖酸轉化率；同時，為解決發(fā)酵后期主副產(chǎn)物過多的問題，采用膜偶聯(lián)透析發(fā)酵的過程控制方式達到解除產(chǎn)物反饋抑制以及大量去除丙氨酸的目的，使得發(fā)酵液中L-纈氨酸和L-丙氨酸含量維持在較低的水平，此工藝能夠在生產(chǎn)提取環(huán)節(jié)中有效降低能源的消耗，提高發(fā)酵液的質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

谷氨酸棒狀桿菌XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr），天津科技大學代謝工程研究室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉10 g/L、玉米干粉10 g/L、NaCl 2.5 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L、VB10.3 mg/L、VH 200 μg/L、玉米干粉20 g/L（121 ℃、20 min單獨滅菌）、豆粕水解液10 mL/L、酵母粉5 g/L、微量元素混合液1 mL/L、蛋氨酸1 g/L。115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖80 g/L、KH2PO42.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.8 g/L、VB10.2 mg/L、VH（20、50、80、120 μg/L）、玉米漿（121 ℃、20 min單獨滅菌）、豆粕水解液20 mL/L、微量元素混合液1 mL/L、谷氨酸5 g/L、亮氨酸0.22 g/L、異亮氨酸0.1 g/L、蛋氨酸0.7 g/L。115 ℃滅菌15 min。

透析培養(yǎng)基：KH2PO45 g/L、MgSO4·7H2O 3 g/L、VB12 mg/L、玉米干粉5 g/L（121 ℃、20 min單獨滅菌）、微量元素混合液10 mL/L。115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；5 L自動控制發(fā)酵罐、30 L自動控制發(fā)酵罐上海保興生物設備工程有限公司；KQ-C高壓蒸汽發(fā)生器上海奉賢協(xié)新機電廠；1 2 0 0高效液相色譜儀、C18柱（15 mm×4.6 mm，3.5 μm） 美國Agilents Technologies公司；恒溫水浴鍋HH-4 金壇市科學儀器廠；752分光光度計 上海分析儀器廠；SS-325型全自動滅菌鍋 日本Tomy儀器有限公司；生物顯微鏡日本Olympus株式會社；FA2204B電子天平 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)與發(fā)酵

菌種在-80 ℃的環(huán)境下保藏在20%的甘油管中。接種于試管斜面活化24 h，于200 mL茄型瓶上擴培24 h。

5 L罐發(fā)酵培養(yǎng)種子，發(fā)酵液定容至3 L，溫度32 ℃，初始通風量為2 L/min，轉速200 r/min，通過自動流加氨水控制pH 7.0～7.2，以泡敵消泡，培養(yǎng)14 h左右，菌體量生長至OD600nm為1.1時接種發(fā)酵。

30 L罐進行發(fā)酵，接種量15%～20%，定容至15 L，溫度32 ℃，初始通風量0.5 m3/h，轉速200 r/min，通過自動流加氨水控制pH 7.0～7.2，罐內(nèi)糖質量濃度降至15 g/L時，按照一定脈沖比流加補糖，維持殘?zhí)琴|量濃度為10～15 g/L，以泡敵消泡，培養(yǎng)52 h。

1.3.2 生物素添加量梯度控制發(fā)酵

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，以生物素添加量為變量，選取20、50、80、120 μg/L四個梯度，分別進行3 個批次實驗，記錄實驗數(shù)據(jù)并繪制曲線圖。

1.3.3 在線膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵

發(fā)酵過程中進行取樣測定，在L-纈氨酸與L-丙氨酸達到一定量時，對發(fā)酵液進行膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵[19-21]處理（約28 h），同時向罐內(nèi)補加新配制的經(jīng)過滅菌處理的透析培養(yǎng)基，具體控制補加透析培養(yǎng)基速率與透析速率保持一致：每透析出1 L發(fā)酵清液，向罐內(nèi)加入1 L透析培養(yǎng)基，使罐內(nèi)發(fā)酵液體積維持在一定的量（28 h時約16 L）。每次透析時間控制在30 min左右，統(tǒng)計數(shù)據(jù)繪制曲線時計入實際發(fā)酵時間。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 葡萄糖含量測定

每間隔4 h取樣離心，取上清液，利用SBA生物分析儀測定發(fā)酵液內(nèi)殘?zhí)呛?；電子天平稱質量測量記錄每4 h流加補糖的量。

1.3.4.2 菌體量測定

每間隔4 h取樣，樣品用去離子水稀釋20 倍，在600 nm波長處測定OD值。

1.3.4.3 pH值測定

梅特勒pH電極在線檢測，pH精密試紙輔助矯正。

1.3.4.4 溶氧測定

梅特勒溶氧電極在線檢測。

1.3.4.5 溫度測定

溫度電極在線檢測。

1.3.4.6L-纈氨酸及L-丙氨酸測定

發(fā)酵液中L-纈氨酸與L-丙氨酸含量用高效液相色譜法分析測定[22-23]。采用Agilent C18（15 mm×4.6 mm，3.5 μm）色譜柱，衍生劑為2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，有機相為50%乙腈溶液，無機相為4.1 g/L醋酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

糖酸轉化率計算如下式所示：

所有實驗數(shù)據(jù)取3 次實驗的平均值。單因素方差分析之后Dunnettt檢驗確定數(shù)據(jù)差異的顯著性（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 生物素添加量對菌體生長及L-纈氨酸產(chǎn)率的影響

圖1 不同生物素添加量下發(fā)酵液的OD600 nmFig. 1 The absorbance of zymotic fluid under different contents of biotin

圖2 不同生物素添加量下L-纈氨酸產(chǎn)量Fig. 2 Production of L-valine under different contents of biotin

經(jīng)過14 h的種子培養(yǎng)及52 h的發(fā)酵培養(yǎng)，隨生物素添加量的增加，菌液OD600nm分別達到了1.621、1.761、1.768和1.830（圖1），L-纈氨酸的最終產(chǎn)量分別達到了48、72、64 g/L和58 g/L（圖2）。可見生物素添加量對L-纈氨酸產(chǎn)量的影響顯著：在發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素添加量越高，菌體生長越快，最終菌體濃度越高；生物素添加量過高時，菌體生長迅速，發(fā)酵前期產(chǎn)酸速率高，中后期產(chǎn)酸速率下降，最終產(chǎn)量降低；生物素添加量為50 μg/L左右時，L-纈氨酸產(chǎn)量最高，菌體量生長適中。

2.2 生物素添加量對菌體耗糖速率及糖酸轉化率的影響

圖3 不同生物素添加量下發(fā)酵液內(nèi)的殘?zhí)荈ig. 3 Residual glucose in fermentation liquor with different biotin additions

圖4 不同生物素添加量下每升發(fā)酵液每4 h耗糖量Fig. 4 Glucose consumption of fermentation liquor every 4 hours with different biotin additions

表1 不同生物素添加量下發(fā)酵參數(shù)對比Table 1 Comparison of fermentation parameters with different amount of biotin addition

經(jīng)測算耗糖量，在初糖質量濃度80 g/L的發(fā)酵中，隨生物素添加量的增加，初糖質量濃度降至10 g/L水平所需發(fā)酵時間減少，依次為22、19、18、16.5 h（圖3），可見菌體耗糖速率與生物素添加量呈正相關；如圖4所示，根據(jù)每4 h所記錄流加糖量，發(fā)酵進行至30 h左右時，耗糖進入高峰階段，菌體生長速率趨于平緩，菌體消耗的葡萄糖更多的用于合成代謝產(chǎn)物，此時L-纈氨酸與L-丙氨酸皆處于快速生成階段；發(fā)酵結束時，生物素添加量由低到高的批次糖酸轉化率依次為24%、32%、27%和22%（表1、圖5）。可見，控制生物素添加量可有效提高L-纈氨酸的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，提高發(fā)酵生產(chǎn)的效益。

圖5 不同生物素添加量下的糖酸轉化率Fig. 5 Conversion rate of sugar and acid with different biotin additions

2.3 生物素添加量對副產(chǎn)物L-丙氨酸的影響

L-丙氨酸作為L-纈氨酸發(fā)酵的主要副產(chǎn)物，易溶于水，嚴重影響L-纈氨酸發(fā)酵的轉化率以及下游提取效率，因此，有效控制發(fā)酵中L-丙氨酸產(chǎn)量是亟待解決的問題。如圖6所示，發(fā)酵結束時，隨生物素添加量的增加，L-丙氨酸產(chǎn)量分別為9、12、15、22 g/L?？梢奓-丙氨酸產(chǎn)量與生物素添加量呈正相關。

圖6 不同生物素添加量下L-丙氨酸含量Fig. 6 Production of L-alanine with different biotin additions

2.4 在線膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝

圖7 50 μg/L生物素添加量下L-纈氨酸與L-丙氨酸的產(chǎn)量Fig. 7 Production of L-alanine and L-valine under 50 μg/L of biotin

選取生物素添加量50 μg/L的發(fā)酵批次作為標準，每間隔4 h取樣離心，測定發(fā)酵液中L-丙氨酸含量與L-纈氨酸含量，結果如圖7所示。在發(fā)酵前中期，菌體處于生產(chǎn)L-纈氨酸速率較高的階段；發(fā)酵后期，L-纈氨酸產(chǎn)酸速率下降，L-丙氨酸產(chǎn)酸速率提升，因發(fā)酵液內(nèi)L-纈氨酸產(chǎn)量過高而產(chǎn)生反饋抑制現(xiàn)象，菌體內(nèi)代謝流量更多地流向L-丙氨酸方向，使得L-丙氨酸產(chǎn)量增多，降低了L-纈氨酸的轉化效率。

圖8 膜偶聯(lián)透析下發(fā)酵液內(nèi)L-纈氨酸與L-丙氨酸產(chǎn)量Fig. 8 Production of L-alanine and L-valine under membrane coupled intermittent dialysis fermentation

如圖8所示，采用在線膜偶聯(lián)透析發(fā)酵工藝，在發(fā)酵進行至28 h時，罐內(nèi)L-纈氨酸質量濃度累積至40 g/L，L-丙氨酸質量濃度累積超過了3 g/L，主產(chǎn)物受到抑制，副產(chǎn)物進入快速生成階段，此時對發(fā)酵液進行在線膜偶聯(lián)透析，分離出發(fā)酵液內(nèi)較高質量濃度的L-纈氨酸和L-丙氨酸，截留罐內(nèi)菌體，使其在新加入的透析培養(yǎng)基中迅速恢復活力并繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸；透析之后，罐內(nèi)L-纈氨酸質量濃度降至3 g/L左右，L-丙氨酸質量濃度降至0.3 g/L左右，繼續(xù)發(fā)酵24 h左右，罐內(nèi)L-纈氨酸質量濃度再次達到40 g/L，且L-丙氨酸也再次累積至3 g/L，此時對發(fā)酵液進行第2次透析，降低罐內(nèi)主副產(chǎn)物的含量，使發(fā)酵延續(xù)下去，延長菌體產(chǎn)酸周期，并大幅提高單批次發(fā)酵總產(chǎn)酸量。通過膜偶聯(lián)透析發(fā)酵，不僅解除了產(chǎn)物的反饋抑制，還有效降低了副產(chǎn)物質量濃度以及最終產(chǎn)量，為后期發(fā)酵下游提取提供了便利，增大了L-纈氨酸提取收率。如表2所示，透析前后發(fā)酵糖酸轉化率由32%提高到34.5%，主產(chǎn)物產(chǎn)量增加，副產(chǎn)物產(chǎn)量降低，耗糖量也相應增加，罐內(nèi)發(fā)酵液體積更接近初始裝液量，穩(wěn)定性增強。

表2 不同發(fā)酵工藝類型基本參數(shù)對比Table 2 Comparison of fermentation parameters under different fermentation modes

3 討 論

生物素對發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸產(chǎn)量影響是通過控制其細胞膜合成量以及細胞轉型時期控制L-纈氨酸胞外含量，生物素小分子在參與羧化作用時，能夠結合羧基，參與菌體內(nèi)固定CO2的羧化反應；作為乙酰輔酶A羧基酶的成分在脂肪酸的合成中起重要作用，進而影響了磷脂的合成，最終決定細胞膜的合成量[24-27]。在菌體量少而生物素相對較多的發(fā)酵前期，對于發(fā)酵罐內(nèi)的生產(chǎn)菌，生物素屬于過量狀態(tài)，此時，菌體在這種環(huán)境下大量增長，當菌體量增長到一定量時，罐內(nèi)的生物素含量對于大量菌體處于亞適量的狀態(tài)，在生物素不足的情況下，菌體生長速度減緩，細胞膜合成變?nèi)酰毦M入轉型階段，新產(chǎn)生菌體的細胞膜因缺少生物素而生長不完全，封閉性減弱，通透性增強，截留能力減弱，胞內(nèi)外物質交換能力增強，菌體內(nèi)生成的大量L-纈氨酸分泌至胞外，解除了菌體內(nèi)L-纈氨酸的反饋抑制作用，L-纈氨酸進入快速發(fā)酵合成時期。當生物素添加量過少時，菌體生長所必需的生物素量不足，導致菌體生長速度減緩，且轉型期提前，轉型之后的菌體產(chǎn)酸速率較高，但是生長緩慢，導致總菌體量過低，進而導致總產(chǎn)酸過低；當生物素添加量過多時，菌體生長增殖速度加快，轉型期滯后，前期產(chǎn)酸低，且發(fā)酵中后期菌體轉型不完全，從而造成中后期產(chǎn)酸速率減弱、L-纈氨酸總產(chǎn)量降低的結果。

楊毅等[28]探究了生物素與VB1的添加量在谷氨酸棒桿菌過量合成L-纈氨酸中對碳骨架代謝流分布的影響，尤其是對丙酮酸節(jié)點處的代謝流分布的影響，研究提出，谷氨酸棒桿菌在添加生物素時促進了丙酮酸的羧化，從而使丙酮酸更多地流入糖異生途徑，減少L-纈氨酸的產(chǎn)量。本實驗使用的菌株XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）在進行生物素不同梯度實驗對比之后發(fā)現(xiàn)，增大生物素添加量后，菌體生物量的確有所增長，但是副產(chǎn)物L-丙氨酸含量增長更為明顯，因此在利用谷氨酸棒桿菌XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸時，造成L-纈氨酸產(chǎn)量下降的主要原因是丙酮酸節(jié)點流量過多地流向丙氨酸途徑，從而減弱了L-纈氨酸途徑，使產(chǎn)酸減少。因此，如果能夠從代謝改造的途徑對菌種XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）的丙氨酸合成途徑進行干擾或者削弱，丙酮酸節(jié)點流向L-纈氨酸的途徑勢必有所增加，從而進一步提高L-纈氨酸產(chǎn)量，然而，代謝改造的途徑周期漫長，且改造所得菌株生長產(chǎn)酸皆會受到不同程度的影響，短時間內(nèi)無法獲得合適的生產(chǎn)菌株解決發(fā)酵生產(chǎn)中副產(chǎn)物L-丙氨酸過高的問題，而采用在線膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝能夠直接有效地減少L-丙氨酸的生成，最終發(fā)酵液中L-丙氨酸質量濃度保持在3 g/L左右，相較之前的12 g/L降了75%左右，是行之有效的解決方式。

4 結 論

生物素的外源添加對于菌體細胞自身的生長與產(chǎn)酸必不可少，本研究通過對生物素添加量進行梯度控制，確定了谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸過程中最適的生物素添加量。實驗表明，當生物素添加量為50 μg/L時，經(jīng)過52 h的發(fā)酵，L-纈氨酸產(chǎn)量達到72 g/L，糖酸轉化率達到32%；在線膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵對于發(fā)酵液中主要產(chǎn)物的反饋抑制解除以及副產(chǎn)物的去除具有非常明顯的效果，較透析之前，透析后的L-纈氨酸總產(chǎn)量提高了47.4%，轉化率提高了2.5%，同時副產(chǎn)物L-丙氨酸產(chǎn)量下降了75%。目前，膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵還存在一些有待改進的方面，例如每次從罐中透析出的體積控制精度較差，透析膜中的循環(huán)液體積有殘留，如果能夠對微濾膜進行一些改進，解決上述問題，可進一步提高生產(chǎn)效益。