陳 偉，谷新晰，黃 蕾，李 晨，田洪濤，盧海強*

（河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是一類作用于β-1,4-甘露糖苷鍵的內(nèi)切水解酶，簡稱甘露聚糖酶[1]。依據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的差異，目前甘露聚糖酶可分為4 個家族，分別是GH5家族、GH26家族、GH113家族和GH134家族[2]。甘露聚糖酶廣泛地分布于軟體動物、植物和微生物之中，其中微生物是生產(chǎn)用甘露聚糖酶的主要來源[3]。甘露聚糖酶在寡糖的制備、飲料的澄清及濃縮加工過程中存在著巨大的應用潛力[4]。然而隨著甘露聚糖酶在實際生產(chǎn)中的應用，逐步暴露出一些亟待解決的問題，如較低的酶活力以及較差的耐受性。

嗜熱酶具有較高的酶促反應溫度和較好的耐受性，已經(jīng)成為酶制劑研發(fā)的重要領(lǐng)域[5]。迄今為止，人們已經(jīng)從不同環(huán)境中成功獲得了30 個嗜熱甘露聚糖酶[6]，其中來源于Talaromyces leycettanus JCM12802菌株的Man5A（AJF11663）的酶促反應溫度最高（90 ℃），且在70 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性[7]。Yang Hong等[8]從嗜熱真菌Neosartorya sp. P1中獲得了嗜熱甘露聚糖酶Man5P1，并在豆乳加工過程取得了較好的應用效果。因此，積極挖掘甘露聚糖酶資源，已成為研究的熱點領(lǐng)域。

近年來，果汁飲料在我國發(fā)展?jié)摿薮?，而加工過程中出現(xiàn)的果汁渾濁制約著果汁產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展[9]。果汁中除含維生素、單寧和果糖等物質(zhì)外，還含有淀粉、果膠、纖維素和半纖維素等非水溶性物質(zhì)，而這些非水溶性物質(zhì)極易造成果汁的渾濁。當前，研究人員已將果膠酶、阿拉伯聚糖酶、蛋白酶和淀粉酶等酶類用來進行果汁澄清處理并取得了一定的效果[10]。甘露聚糖作為一種重要的半纖維素廣泛地分布在水果中，而利用甘露聚糖酶提高果汁澄清相關(guān)報道較少，探究嗜熱甘露聚糖酶作為果汁澄清用酶的潛力具有較強的理論和應用價值。

本研究擬對嗜熱真菌Neosartorya sp. HBFH9中GH5家族甘露聚糖酶基因進行克隆、表達及相關(guān)酶學性質(zhì)的研究，并探究其在果汁澄清中的應用潛力，這對豐富食品酶類資源及提高果汁加工質(zhì)量具有一定的理論意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

真菌HBFH9（Neosartorya sp. HBFH9），巴斯德畢赤酵母GS115和質(zhì)粒pPIC9k由本實驗保存；Trans 1-T1北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pMDTM19-T、Fast pfu DNA聚合酶、T4 DNA酶、EcoR I、Not I和Bgl II等酶大連寶生物公司；PDA培養(yǎng)基 上海博微生物科技有限公司。

參照畢赤酵母表達手冊制備MD瓊脂板、生長培養(yǎng)基（BMGY）和誘導培養(yǎng)基（BMMY）；引物合成和核酸測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。發(fā)酵培養(yǎng)基：角豆膠（0.3%），NH4NO3（0.5%），KCl（0.05%），MgSO4·7H2O（0.05%），MnSO4·4H2O（0.03%），F(xiàn)eSO4·7H2O（0.03%），pH 6.0。

1.2 儀器與設備

立式高速低溫離心機 日本Hitachi公司；Biometra Tprofessional聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國Biometra公司；TU-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；1652100電穿孔儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 甘露聚糖酶基因的克隆

菌株Neosartorya sp. HBFH9在PDB培養(yǎng)基中30 ℃培養(yǎng)72 h后，離心收集菌體。采用CTAB法對真菌HBFH9提取基因組，-20 ℃保藏備用。采用兼并引物（MP1和MP2）擴增保守序列[11]，通過瓊脂糖電泳檢測擴增產(chǎn)物，將符合大小的片段和pEASY-T3載體進行連接和轉(zhuǎn)化，陽性轉(zhuǎn)化子由生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。

將真菌HBFH9接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，45 ℃搖床誘導培養(yǎng)3 d，收集菌體。使用SV Total RNA Isolation System試劑盒提取菌株HBFH9總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA的第一條鏈。參考Aspergillus fischeri NRRL 181中的XP_001262238.1基因序列設計引物（PF和PR），PF（CGGAATTCCAGGTTGG TCCTTGGGGCCAGTGTGG）和PR（GAATGCGGCCGC CTAGATTCGGCTGACATGATC），進行PCR測定，將擴增產(chǎn)物進行回收后連接T載體，構(gòu)建pMDTM19T-nsMan5B質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入Trans1-T1宿主，陽性轉(zhuǎn)化子由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3.2 序列信息分析

使用Vector NTI 11.0軟件對測序結(jié)果進行分析。使用FGENESH（http://linux1.softberry.com/）軟件對基因的內(nèi)含子和外顯子位點進行預測分析。使用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對基因序列進行比對分析。使用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）在線工具預測酶蛋白的分子質(zhì)量和等電點。使用SignalP 4.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件進行酶蛋白信號肽位點預測。使用NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）在線工具預測酶蛋白分子的N-糖基化位點。利用Swiss-Mode服務器（https://www.swissmodel.expasy.org）預測酶蛋白分子的三維結(jié)構(gòu)，并利用Pymol軟件進行分析。

1.3.3 重組菌株的構(gòu)建

將pMDTM19T-nsMan5B質(zhì)粒進行EcoR I和Not I雙酶切，并與質(zhì)粒pPIC-9k進行連接反應構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k-nsMan5B，并將陽性轉(zhuǎn)化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析。

提取陽性pPIC9k-nsMan5B質(zhì)粒，使用限制性酶Bgl II酶切pPIC9k-nsMan5B質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)，利用酶活性篩選方法對轉(zhuǎn)化子進行篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.4 重組菌株誘導表達及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

挑取單陽性轉(zhuǎn)化子至50mL YPD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)（30 ℃，250 r/min）12 h后，將其以1%的接種量接種于200 mL BMGY中，在搖床中30 ℃培養(yǎng)48 h。參照畢赤酵母表達手冊方法，收集菌體并轉(zhuǎn)接至BMMY培養(yǎng)基搖床繼續(xù)培養(yǎng)72 h，維持甲醇體積分數(shù)為0.5%。離心收集發(fā)酵液，即為粗酶液，進行活力測定及SDS-PAGE分析。

1.3.5 甘露聚糖酶酶學性質(zhì)分析

甘露聚糖酶酶活測定參考Miller[12]的DNS方法。取100 μL適當稀釋酶液和900 μL角豆膠（0.5%），在pH 5.0，50 mmol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，60 ℃反應10 min后，加入1.5 mL DNS終止反應。對照則在加入1.5 mL DNS后，再補加100 μL稀釋酶液。沸水浴5 min并冷卻至室溫后在波長540 nm處測定吸光度。參照Sakai等[13]的方法，以甘露糖的量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

酶活單位：以每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。

1.3.5.1 pH值對重組酶NsMan5B的影響

在pH 2.0～12.0范圍條件下，測定重組酶NsMan5B的酶活力，以酶活力最高值為100%計算，分析該酶的pH值反應范圍。將重組酶NsMan5B在pH 2.0～12.0的條件下，37 ℃處理1 h，對照為未進行處理的酶，按照標準酶活力測定方法測定酶活力，分析其pH耐受性。

1.3.5.2 溫度對重組酶NsMan5B的影響

將重組酶NsMan5B在最適pH值下，分別在溫度為30～70 ℃范圍內(nèi)，測定重組酶NsMan5B的酶活力，以酶活力最高值為100%計算，分析其反應溫度范圍。將重組酶在50、60、70 ℃條件下，分別孵育0、5、10、20、30 min和60 min后，測定酶活力，以0 min處理的酶活力值為100%計算，分析該酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.5.3 金屬離子和化學試劑對重組酶NsMan5B活性的影響

在標準反應條件下，分別測定終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的金屬離子酶活力，探究金屬離子和化學試劑對酶活力的影響，為重組酶的貯藏、純化及應用提供一定的理論指導。

1.3.5.4 重組酶NsMan5B動力學參數(shù)測定

重組酶NsMan5B在最適反應條件下，以不同濃度（1.0～10.0 mg/mL）的角豆膠溶液為底物測定酶活力，根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk法）求得Km和Vmax。

1.3.6 重組酶NsMan5B在果汁澄清中的應用

果汁澄清度的測定[14]：蘋果、杏、柿子、葡萄、梨和橘子，按照柿子與水質(zhì)量比1∶4壓榨，經(jīng)膠體磨進一步處理，獲得柿子汁樣品。將蘋果、梨、桃子、葡萄、柿子和橘子水果清洗干凈、晾干水分，參照Hayrunnisa等[14]方法進行榨汁處理，并保存4 ℃?zhèn)溆?。? mL酶液添加到10 g果汁中，在pH 5.0、60 ℃反應1 h后，在660 nm波長處測定吸光度，以透光率作為果汁澄清度指標參數(shù)，以添加等量滅活酶的果汁反應液作為空白對照組。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

每次實驗重復測定3 次，利用Excel和SPSS19.0軟件對測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 nsMan5B基因序列分析

經(jīng)對菌株Neosartorya sp. HBFH9的GH5家族甘露聚糖酶保守序列擴增，共獲得2 個180 bp左右的片段。經(jīng)分析均屬于GH5家族甘露聚糖酶，分別命名為nsMan5A和nsMan5B，基因nsMan5A序列與已報道的Man5P1一致性最高（99%），基因nsMan5B序列與Aspergillus fischeri NRRL 181中的XP_001262238.1一致性為99%，而到目前為止，并無該基因相關(guān)功能報道。經(jīng)分析，nsMan5B基因由1 491 bp核苷酸組成，2 個內(nèi)含子（I內(nèi)含子950～1 009 bp，II內(nèi)含子1 140～1 199 bp），cDNA全長1 371 bp核苷酸，編碼456 個氨基酸和1 個終止密碼子。理論分子質(zhì)量約為49.5 kDa，等電點為5.0，該蛋白含有1 個信號肽序列（1-18AA），不存在N-糖基化位點。經(jīng)結(jié)構(gòu)預測分析，成熟NsMan5B酶蛋白分子由3 部分組成：碳水化合物結(jié)合區(qū)（CBM1，1～30）、linker區(qū)（31～103）和催化區(qū)（104～423）。經(jīng)序列比對分析（圖1），nsMan5B基因序列與已報道的嗜熱甘露聚糖酶ManBK基因序列（PDB：3wh9）一致性為46.7%,，與C.antarcticus中的甘露聚糖酶（PDB：4oou）基因序列一致性為12.7%，與Trichoderma reesei中甘露聚糖酶（PDB：1QNR）基因序列一致性為43.4%。經(jīng)三維結(jié)構(gòu)比對分析，NsMan5B具有典型的（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)，兩個催化位點分別是281E和390E，屬于GH5家族。

圖1 甘露聚糖酶NsMan5B序列比對分析Fig. 1 Amino acid sequence alignment of NsMan5B using the ClustalW program

2.2 重組菌nsMan5B基因誘導表達及產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將重組菌株進行誘導表達之后，對細胞發(fā)酵液進行酶活檢測，發(fā)酵液中酶活為7.8 U/mL。進一步對重組菌發(fā)酵液進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖2。發(fā)酵產(chǎn)物在約49 kDa處出現(xiàn)目標蛋白條帶，這與NsMan5B酶蛋白分子理論分子質(zhì)量基本上一致，不存在糖基化修飾。

圖2 甘露聚糖酶NsMan5B的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of recombinant NsMan5B

2.3 重組酶NsMan5B酶學特性分析

圖3 甘露糖酶NsMan5B的酶學性質(zhì)Fig. 3 Effects of pH and temperature on the β-mannanase activity of recombinant NsMan5B

由圖3A、C可知重組酶NsMan5B的最適反應溫度為60 ℃，屬于嗜熱酶。在70 ℃反應下具有90%以上的酶活性，即使在90 ℃時依然能夠維持50%以上活性，該酶的反應溫度范圍較廣，30～90 ℃都能夠檢測到該酶的活性。在50 ℃條件下，重組酶NsMan5B酶基本穩(wěn)定，在處理1 h后，能夠維持80%以上的酶活性；60 ℃處理1 h后，酶活損失約50%；而70 ℃條件處理1 h后能夠維持原活性的40%。

由圖3B、D可知，重組酶NsMan5B具有較廣的pH值作用范圍，在pH 2.0～11.0范圍內(nèi)都表現(xiàn)出一定的酶活性，該酶的最適反應pH值為4.0，在酸性范圍內(nèi)（3.0＜pH＜7.0）酶活性較高，能夠維持80%以上的酶活性。隨著pH值的逐漸升高，酶活性也隨之降低，直至pH 11.0，該酶活性完全喪失。

經(jīng)對重組酶NsMan5B的酸堿耐受性分析發(fā)現(xiàn)，該酶在pH 2.0～11.0范圍內(nèi)處理1 h后酶活力基本維持穩(wěn)定，即使在堿性條件下（7.0＜pH＜11.0）依然能夠維持75%以上的酶活力，而在pH 12.0條件下處理后酶活力喪失較明顯，只能維持原酶活性的20%左右。經(jīng)動力學性質(zhì)測定該酶的Vmax為76.3 μmol/（min·mg），Km為1.26 mg/mL。

2.4 金屬離子和化學試劑對重組酶活力的影響及動力學參數(shù)測定

金屬離子對重組甘露聚糖酶活性的影響差異較大，且不同離子濃度會對酶活性造成不同影響。由表1可知，在低離子濃度（1 mmol/L）條件下，Zn2＋、Fe3＋和Cu2＋顯著促進了重組酶NsMan5B的活性，使其活性分別提升了66%、32%和23%。除了Ca2＋和K＋對重組酶NsMan5B起到了較明顯抑制外，其他金屬離子都未對重組酶的活性表現(xiàn)出強烈抑制。而在高離子濃度條件下，除了Mn2＋外，其他金屬離子都極顯著的促進了重組酶NsMan5B的活性，其提升幅度從19%～244%不等。其中K＋和Cu2＋促進作用最為明顯，分別使重組酶活性增加了2.4 倍和1.2 倍。不論是在高濃度還是低濃度，化學試劑并未同金屬離子一樣表現(xiàn)出明顯的促進作用。醇類物質(zhì)已被廣泛用來進行酶液的初步濃縮[15]，經(jīng)對幾種醇類物質(zhì)影響分析發(fā)現(xiàn)，大體隨著醇分子主鏈的延長，醇對重組酶NsMan5B活性的抑制作用越來越顯著，醇體積分數(shù)越大，抑制越明顯，如：在體積分數(shù)2.5%正丁醇溶液條件下，重組酶只能維持原活性的14%左右。表面活性劑吐溫80和變性劑尿素都對重組酶表現(xiàn)出較強的抑制作用。

表1 不同金屬離子和化學試劑對NsMan5B酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions and chemical reagents on β-mannanase activity of recombinant NsMan5B

2.5 重組甘露聚酶NsMan5B對5 種果汁澄清品質(zhì)的影響

采用酶制劑處理果汁原料提升果汁澄清度已被行業(yè)所認可并廣泛應用，如果膠酶、纖維素、淀粉酶及蛋白酶等。甘露聚糖作為一種重要的半纖維素成分，廣泛存在于植物的果實中[16]。因此，利用甘露聚糖酶降解果汁中的甘露聚糖，繼而提高果汁的澄清度是一條可行策略，并已被Nadaroglu等[17]的研究證實。本研究用重組甘露聚糖酶NsMan5B分別處理柿子汁、蘋果汁、桃子汁、葡萄汁和橘子汁。表2顯示，重組酶除對橘子汁外，對其他果汁的澄清度都有不同程度的提高，其中柿子汁最為明顯，提高了31.8%，其他3 種果汁分別提高了7%、4%和4%。

表2 甘露聚酶對果汁澄清效果Table 2 Clarification efficiency of fruit juice by using recombinant NsMan5B %

3 討 論

嗜熱甘露聚糖酶具有能夠提高催化反應速率，降低雜菌污染，簡化生產(chǎn)工藝等優(yōu)點，使得該類酶在食品工業(yè)領(lǐng)域具有較廣的應用前景[18-19]。菌株Neosartoryasp.HBFH9為本課題組從中高溫大曲中篩選獲得，并初步確認為嗜熱真菌（＞45 ℃）。通過對該菌基因組DNA中的GH5家族甘露聚糖酶保守序列的擴增，共獲得2 條GH5家族的甘露聚糖酶基因的保守序列，分別命名為nsMan5A和nsMan5B基因。迄今為止并無nsMan5B基因功能的相關(guān)報道。經(jīng)結(jié)構(gòu)分析，NsMan5B酶蛋白分子的功能結(jié)構(gòu)單元較完整，除具有催化功能的催化區(qū)外，還具有底物識別的碳水化合物結(jié)合區(qū)（CBM）和連接兩功能結(jié)構(gòu)單元的Linker區(qū)。大量研究發(fā)現(xiàn)，Linker區(qū)域?qū)γ阜肿拥姆€(wěn)定性有較大相關(guān)性[20]，該區(qū)域的序列改造是后續(xù)提升重組NsMan5B穩(wěn)定的重要靶點。

大部分真菌來源的甘露聚糖酶最適反應溫度為40～70 ℃[21-23]，重組甘露聚糖酶NsMan5B的最適反應溫度為60 ℃，在70 ℃反應下具有90%以上的酶活性，即使在90 ℃時依然能夠維持50%以上活性，屬于嗜熱酶。當前，已報道的甘露聚糖酶Man5A（AJF11663）的酶促反應溫度最高（90 ℃），但該酶的pH值范圍較窄，當pH＞7.0時，酶活力完全消失，而重組酶NsMan5B卻表現(xiàn)出較出色的pH值反應范圍及較強的酸堿耐受特性。

甘露聚糖酶N s M a n 5 B的最適p H值為4.0，這與T.terrestris來源的甘露聚糖酶（pH 4.5），P. chrysosporium來源的甘露聚糖酶（pH 4.0）及A. nigerBK01來源的甘露聚糖酶（pH 4.5）較一致[24-25]。在pH 8.0條件下，重組酶NsMan5B能夠維持60%的酶活性；即使在pH 9.0條件下，依然能保持30%以上的酶活性。真菌來源的甘露聚糖酶在酸性和中性條件下穩(wěn)定，只有很少的一些酶能夠在pH 8.0及以上的堿性條件下穩(wěn)定[26-27]，甘露聚糖酶NsMan5B是一個為數(shù)不多在堿性條件下穩(wěn)定的甘露聚糖酶，即使在pH 10.0堿性條件下處理1 h，酶活力基本能夠維持80%以上，表明該酶較其他嗜熱甘露聚糖酶具有較好的pH值穩(wěn)定性，因此具有更加寬廣的應用范圍。金屬離子和化學試劑對重組酶NsMan5B活性表現(xiàn)出不同的影響，這與該酶的分子結(jié)構(gòu)特點有直接關(guān)系。乙醇在低體積分數(shù)條件下對酶活性有一定的促進作用，在高濃度下受到的抑制作用較小，可以用來作為發(fā)酵酶液的初步濃縮。

酶制劑在果汁加工生產(chǎn)中的應用顯著提高了果汁的出汁率和澄清效果，如果膠酶、纖維素和淀粉酶等酶制劑在果汁加工中的廣泛應用[28]。Nadarouglu等[17]對甘露聚糖酶在果汁中的應用進行探索，發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶在果汁的澄清中發(fā)揮著重要作用，其中對杏汁的作用最為明顯，使澄清度從34%提高到47%。本研究發(fā)現(xiàn)重組甘露聚糖酶NsMan5B同樣對果汁的澄清有提升作用，而對不同品種果汁的澄清效果存在較大的差異，其中對柿子汁的效果最為明顯，這很可能與果汁中的物質(zhì)組成有很大關(guān)系[29]。柿子是我國北方山區(qū)重要的一種水果，目前，柿子深加工還存在較多困難因素，而可應用于柿子汁加工的酶制劑相關(guān)研究較少。重組酶NsMan5B在柿子汁加工的應用潛力還需進一步挖掘，相關(guān)的技術(shù)參數(shù)還需進一步完善。

4 結(jié) 論

本研究成功從嗜熱真菌Neosartorya sp. HBFH9獲得嗜熱甘露聚糖酶nsMan5B基因并進行了表達及相關(guān)性質(zhì)的研究，結(jié)果表明重組甘露聚糖酶NsMan5B屬于嗜熱酶，具有較好的pH耐受性，在果汁的澄清中具有較好的應用效果。本研究不僅豐富了甘露聚糖酶資源，同時也為甘露聚糖酶在果汁加工中的應用提供了一定的理論指導。