楊捍衛(wèi)，唐忠志，郝 謙

隨著人口老齡化到來，因胸痛發(fā)作的急診病人逐漸增多。有研究報道，每年有超過1 000 萬美國人因胸痛而急診就診［1］。急性冠脈綜合征( acute coronary syndrome，ACS) 是胸痛的常見原因，因ACS 急診住院病人逐漸增多，給病人家庭和國家?guī)砭薮蟮呢斦?fù)擔(dān)［2］。若有快速、敏感和特異性高的生物標(biāo)志物鑒別ACS 的不同疾病及其他導(dǎo)致胸痛的原因( 如胃食管反流) ，可給予及時有效治療［3］，早期診斷急性心肌梗死( AMI) 對減輕心肌損傷和保護(hù)心臟功能具有重要臨床意義。

目前AMI 的早期診斷主要基于臨床癥狀、體格檢查、心電圖、肌鈣蛋白( cTn) 和心肌酶譜水平［4］。cTn通常在發(fā)病4～6 h 開始升高，因此連續(xù)監(jiān)測cTn 變化對大多數(shù)急性胸痛病人是不可或缺的。然而檢測心肌cTn 水平對區(qū)分AMI 和其他疾病不是非常敏感且具有特異性，非致死性胸痛也會出現(xiàn)cTn 水平增高［5］，因此，需要靈敏性和特異性更高的新型生物標(biāo)志物早期AMI 診斷。

微小RNA( miRNA) 是由約22 個核苷酸組成的、小的、高度保守的非編碼RNA 分子。miRNA 通過抑制靶基因的信使RNA 翻譯或通過促進(jìn)mRNA 降解調(diào)節(jié)基因表達(dá)。有證據(jù)表明，miRNA 在許多生物過程中起重要作用，包括增殖、分化和凋亡，它們涉及各種類型心血管疾病［6］。許多miRNA 在血漿和其他體液中比較穩(wěn)定且易于檢測，且循環(huán)miRNA 水平在特定的生理和病理條件下變化，表明循環(huán)miRNA 是AMI 的理想生物標(biāo)志物［7］。已有研究表明，梗死心肌中miR-1、miR-133、miR-499 等 miRNA 水平降低，血漿 miRNA 升高，表明循環(huán)中 miRNA 從梗死心臟中釋放［8］。AMI 后血漿miRNA 水平升高反映心肌損傷。田志鵬等［9］研究發(fā)現(xiàn)，AMI 病人全血miRNA-1 表達(dá)水平明顯增高，且與血漿cTnI 表達(dá)水平比較具有更早的時間窗和到達(dá)峰值時間，具有診斷AMI 良好的早期敏感性。有研究表明，miRNA-21 在大鼠心肌梗死后交界區(qū)組織中表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)控心肌梗死后心室重構(gòu)［10-11］。因此可能作為心肌損傷的潛在生物標(biāo)志物。miRNA-21 對AMI 可能具有一定的診斷價值，但需要更多研究證據(jù)證實。目前有關(guān)miRNA-21 在AMI 病人的表達(dá)水平及臨床意義尚不清楚。本研究通過檢測AMI 病人血漿miRNA-21 和肌鈣蛋白T( cTnT) 水平變化，進(jìn)一步探討miRNA-21 在AMI 早期診斷中的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2015 年 4 月—2016 年 12 月因急性胸痛發(fā)作6 h 內(nèi)于急診就診的病人138 例，均行冠狀動脈造影術(shù)，確診 AMI 病人 85 例( AMI 組) ，不穩(wěn)定型心絞痛病人53 例( UAP 組) ，另選取同期在本院體檢中心體檢健康者30 名作為對照組。3 組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P ＞0.05) ，具有可比性。詳見表1。

表1 各組一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn): 有胸痛癥狀，發(fā)病6 h 內(nèi); 心電圖、心肌標(biāo)志物或心肌酶譜等指標(biāo)符合2007年美國心臟協(xié)會( AHA) /美國心臟病學(xué)會( ACC) 制定的心肌梗死標(biāo)準(zhǔn)［12］; 冠狀動脈造影檢查顯示1 支及以上冠狀動脈血管狹窄超過50%; 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，病人自愿參加，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn): 因急性創(chuàng)傷引起的胸痛; 肺栓塞、主動脈夾層等引起的胸痛; 合并肝腎功能不全、心臟瓣膜病、急性感染、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等。

1.3 冠狀動脈造影檢查 由專業(yè)心血管介入醫(yī)師行冠狀動脈造影術(shù)。采用標(biāo)準(zhǔn)Judkins 法，常規(guī)投照體位行左、右冠狀動脈造影。Gensini 評分是評估冠狀動脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的評分系統(tǒng)［13］。1% ～25%管腔狹窄計 1 分，26% ～50%管腔狹窄計 2 分，51% ～75%管腔狹窄計 4 分，76% ～90%腔狹窄計 8 分，91% ～99%管腔狹窄計16 分，完全狹窄計32 分。Gensini 評分越高說明狹窄程度越嚴(yán)重。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 cTnT 檢測 病人在急診即刻抽取靜脈血，健康體檢者于體檢當(dāng)日早晨采集空腹靜脈血。cTnT 采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀( Elecsys 2010，Roche 公司) 進(jìn)行測定。以 cTnT＜0.04 ng /mL 為正常參考值，cTnT＞0.1 ng /mL 為有臨床意義，cTnT＞0.5 ng /mL 為AMI 診斷參考值。

1.4.2 miRNA-21 檢測 病人在急診即刻抽取靜脈血，健康體檢者于體檢當(dāng)日早晨采集空腹靜脈血。具體步驟: 采集靜脈血后，加入到乙二胺四乙酸( EDTA) 處理的抗凝血管中，以3 000 r/min 離心10 min 后分離血漿，之后再以12 000 r/min 離心10 min 分離血漿，置于無RNA 酶的 Ep 管中，－80 ℃保存，集中待測。RNA抽提: 取400 μL 血漿加入到等體積TRIzol 中，在冰上放置5 min 后，加入800 μL 氯仿，并在冰上孵育5 min。4 ℃條件下，以 12 000 r/min 離心 10 min 后，收集上清液。按照 mirVana PARIS 試劑盒說明書( Ambion 公司，美國) 分離總RNA。通過用RNase Free 水洗滌，收集總 RNA( 100 μL) ，之后使用 NanoDrop ND-1000 核酸定量檢測儀檢測RNA 濃度和純度( NanoDrop 公司，美國) 。qRT-PCR: 按照TaqMan microRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書( Ambion 公司，美國) 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，定量檢測血漿樣品中 miRNA。將含有 5 μL RNA 提取物、0.15 μL dNTPs( 100 mmol/L) 、1 μL Multi Scribe RT 酶( 50 U/μL) 、1.5 μL 10×RT-PCR 緩沖液，0.19 μL RNA 酶抑制劑( 20 U/μL) ，1 μL 基因特異性引物( miR-21，Catalog number: 0397 和 U6 snRNA，Catalog number: 1973，由上海生物工程有限公司合成) 和4.16 μL 無核酸酶水加入到反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為16 ℃溫育 30 min，42 ℃溫育 30 min，85 ℃溫育 5 min，然后保持在 4 ℃。qPCR 系統(tǒng)( 20 μL) 包括 10 μL TaqMan 2×Universal PCR 主混合物( 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司) 、1 μL 基因特異性引物( 終濃度 200 nmol/L) 和 7.67 μL無核酸酶擴(kuò)增總共 1.33 μL cDNA，最終體積為 20 μL。qPCR 在7300 實時PCR 系統(tǒng)( 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司) 上進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃下孵育10 min，隨后40個循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。使用 2－ΔΔCT方法計算相對表達(dá)水平，使用U6 作為miRNA-21 表達(dá)的內(nèi)部對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s ) 表示，采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法; 計數(shù)資料采用χ2檢驗，指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析; 利用ROC 曲線評價各指標(biāo)診斷AMI 能力。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組循環(huán)miRNA-21、cTnT 水平比較 單因素方差分析結(jié)果顯示，各組循環(huán)miRNA-21、cTnT 水平差異有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義 ( F 值 分 別 為 214 . 67 ，160 . 96 ，P ＜0.01) ; 進(jìn)一步兩兩比較，與對照組比較，AMI 組和 UAP組循環(huán) miRNA-21、cTnT 水平明顯升高( P ＜0. 01) ;AMI 組循環(huán) miRNA-21、cTnT 水平明顯高于 UAP 組( P＜0.01) 。詳見表 1。

表1 各組miRNA-21 和cTnT 水平比較( x ±s )

2.2 Gensini 評分與循環(huán) miRNA-21、cTnT 水平的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，AMI 組和UAP組 Gensini 評分與循環(huán) miRNA-21、cTnT 水平均呈 正 相 關(guān) ( r = 0 . 8 0 5 ，P = 0 . 0 0 0 ; r = 0 . 6 5 3 ，P =0 .000) ; 循環(huán)miRNA-21與cTnT水平呈正相關(guān)( r =0.801，P = 0.000) 。詳見圖 1～圖 3。

圖1 Gensisni 評分與循環(huán)miRNA-21表達(dá)水平的相關(guān)性分析

圖2 Gensisni 評分與cTnT 水平的相關(guān)性分析

圖3 miRNA-21 表達(dá)水平與cTnT 水平的相關(guān)性分析

2.3 循環(huán) miRNA-21、cTnT 早期診斷 AMI 應(yīng)用價值應(yīng)用ROC 曲線分析循環(huán) miRNA-21、cTnT 早期診斷AMI 的價值，miRNA-21 的 ROC 曲線下面積( AUC) 為0 . 957 ( 95 % CI : 0 . 908 ～ 0 . 984 ，Z = 28 . 083 ，P =0.000) ，miRNA-21 ＞7.12 時，敏感度為 91.76%，特異度 為 9 4 . 3 4 %; cTnT 的 ROC 曲 線 下 面 積 ( AUC ) 為0.877( 95%CI : 0.810 ～0.927，Z = 13.342，P = 0.000) ，cTnT＞0.82 ng /mL 時，敏感度為 87.06%，特異度為 71.70%; 聯(lián)合檢測 miRNA-21、cTnT 對 AMI 診斷價值比較，聯(lián)合檢測 AUC 為 0.973( 95%CI : 0.952 ～ 0.994，Z= 3.334，P = 0.000) ，敏感度為 92.9%，特異度為 95.2%。詳見圖4。

圖4 循環(huán)miRNA-21 和cTnT水平早期診斷AMI 的ROC 曲線

3 討 論

由于冠狀動脈急性閉塞，導(dǎo)致心肌缺血，造成心肌細(xì)胞死亡。目前認(rèn)為循環(huán)cTnT 和 cTnI 是早期診斷AMI 的經(jīng)典生物標(biāo)志物。AMI 是一個復(fù)雜過程，涉及到多種基因參與調(diào)節(jié)。miRNA 是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞30%以上基因的基因調(diào)控者，miRNA 可能參與AMI 的發(fā)病過程。已有研究證實，在梗死邊緣和梗死區(qū)域的早期階段( 6 h) 多種 miRNA 異常表達(dá)［14］。因此，探討具有高特異性和靈敏度的早期診斷AMI 的新型生物標(biāo)志物是非常必要的。

有研究表明，miRNA-21 參與心肌梗死的發(fā)病過程。Zhang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，AMI 病人血漿 miR-21 水平顯著升高。與肌酸激酶( CK) 、肌酸激酶同工酶( CK-MB) 和 cTnI 相比，miRNA-21 具有相似的診斷AMI 能力，可能是AMI 診斷的新型生物標(biāo)志物。本研究以急性胸痛發(fā)作6 h 內(nèi)的急診病人為研究對象，目的是通過檢測胸痛病人循環(huán)miRNA-21 表達(dá)水平，分析miRNA-21 與冠狀動脈病變的關(guān)系，進(jìn)一步闡明miRNA-21 作為AMI 早期診斷標(biāo)志物的潛在應(yīng)用價值。本研究結(jié)果顯示，胸痛發(fā)作6 h 內(nèi)的急診病人，血漿miRNA-21 表達(dá)水平明顯高于對照組，且AMI 組循環(huán)miRNA-21 表達(dá)水平較UAP 組明顯升高，AMI 病人miRNA-21 表達(dá)水平與血漿cTnT 水平呈正相關(guān)。ROC曲線分析顯示，血漿miRNA-21 對AMI 具有良好的診斷價值，AUC 為 0.957，95%CI ( 0.908～0.984) 。與 cT-nT 的 AUC［0.877，95%CI ( 0.810 ～0.927) ］比較，miR-21 的診斷價值稍高于cTnT，且miRNA-21 的敏感度和特異性均高于cTnT。兩者結(jié)合診斷 AMI，AUC 為0.973［95%CI ( 0.952～0.994) ］，敏感度和特異性均明顯高于單用miRNA-21 和cTnT。說明聯(lián)合檢測miRNA-21 和cTnT 能早期準(zhǔn)確地診斷AMI。與經(jīng)典的AMI 生物標(biāo)志物cTnT 結(jié)合，miRNA-21 可能是提高診斷敏感性和特異性的潛在新型生物標(biāo)志物。

已有研究表明，miRNA-21 在多種心血管疾病中起重要作用［16］。管文娟等［17］研究發(fā)現(xiàn)，冠心病病人外周血miRNA-21 高表達(dá)，AMI 組血漿miRNA-21 表達(dá)水平顯著高于心絞痛組，且與冠狀動脈病變嚴(yán)重程度具有正相關(guān)性。Darabi 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，ACS 病人血清miRNA-21 水平顯著高于穩(wěn)定型冠狀動脈疾病病人，miRNA-21 增高可能通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)參與ACS 發(fā)病機(jī)制。抑制miRNA-21 表達(dá)可通過M2 巨噬細(xì)胞的抗炎作用減少支架再狹窄［19］。miRNA-21 參與冠狀動脈動脈粥樣硬化過程，與調(diào)控炎性因子、促進(jìn)炎癥反應(yīng)影響斑塊穩(wěn)定性有關(guān)，miRNA-21 增高導(dǎo)致冠心病病人心血管事件發(fā)生風(fēng)險增高。本研究結(jié)果顯示，隨著冠狀動脈Gensini 評分增加，AMI 組和UAP 組血漿miRNA-21 和cTnT 水平增加，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胸痛病人血漿miRNA-21 和cTnT 水平與Gensini 評分均呈正相關(guān)。由此可見，血漿miRNA-21 和cTnT 水平可作為判斷AMI 發(fā)生、評估冠狀動脈病變程度及預(yù)后的重要指標(biāo)。有研究表明，血漿miRNA-21 水平增高具有抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)心肌等作用。Han 等［20］研究證實，敲除miRNA-21 基因可抑制缺血預(yù)處理介導(dǎo)的對局部缺血/再灌注損傷的心臟保護(hù)作用，miRNA-21 對缺氧/再氧化誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。缺血起始miRNA-21 表達(dá)增高，miRNA-21 表達(dá)增高通過PTEN/PI3K/Akt 信號傳導(dǎo)通路起到抑制心肌干細(xì)胞凋亡的作用［21］。

由于miRNA 在生物系統(tǒng)中的復(fù)雜性，除了患有ACS 病人的不同遺傳、社會和治療特征之外，本研究病人樣本量有限，人口之間差異可能影響研究結(jié)果，因此需要擴(kuò)大樣本量、納入不同地區(qū)人群進(jìn)一步驗證研究結(jié)果。本研究不足之處在于未系統(tǒng)觀察miRNA-21 在AMI 發(fā)病過程中表達(dá)水平變化，這也限制了胸痛癥狀發(fā)作時精確識別miRNA-21 失調(diào)能力及對AMI 病人預(yù)后的評估價值。今后研究將在AMI 病人住院的不同時間檢測miRNA-21 表達(dá)水平，并進(jìn)行出院后隨訪，評估m(xù)iRNA-21 表達(dá)水平與AMI 預(yù)后結(jié)局之間關(guān)系。

綜上所述，AMI 病人miRNA-21 表達(dá)水平明顯增高，與cTnT 、冠狀動脈病變存在一定的相關(guān)性，miRNA-21 對早期診斷AMI 具有良好的診斷價值。聯(lián)合檢測 miRNA-21 和 cTnT 可早期準(zhǔn)確地診斷 AMI。miRNA-21 可能是提高診斷敏感性和特異性的潛在新型生物標(biāo)志物。