梁軍， 賈玉鑫， 宮凡淇， 祝光濤

(云南師范大學 生命科學學院,馬鈴薯科學研究院，云南省馬鈴薯生物學重點實驗室，云南省高校馬鈴薯生物學重點實驗室，云南 昆明650500)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄屬的一年生草本植物，在全世界內廣泛種植.在我國糧食結構中，馬鈴薯是繼小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物[1].在馬鈴薯生長發(fā)育過程中，由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病(Late blight)嚴重影響馬鈴薯的生長和結薯.19世紀中期，由于歐洲地區(qū)晚疫病的大面積爆發(fā)，導致了愛爾蘭大饑荒，至少100萬人死亡[2].2009年，這種毀滅性的疾病導致了馬鈴薯全球產量降低了16%，對全球糧食安全造成了重大的威脅[3].因此研究馬鈴薯響應致病疫霉侵染的分子機制對于防治晚疫病、保障我國乃至世界的糧食安全具有重要意義.

在演化過程中，植物與病原菌進行著長期且持續(xù)的共進化斗爭.植物防御過程中的第一道防線，稱為病原相關分子模式引發(fā)的免疫反應(PAMP-triggered immunity，PTI).植物通過細胞表面的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)，識別細菌的鞭毛蛋白FLG22，通過MAPK級聯(lián)反應[4]，啟動植物的第一道防御機制.FLG22鞭毛蛋白是微生物表面的一類高度保守的蛋白，在N端含有22個保守的氨基酸[5].在植物中，鞭毛蛋白受體(Flagellin sensitive 2，F(xiàn)LS2)被證明能夠識別FLG22，進而起始PTI類型的免疫應答[6].植物通過激活MAPKs信號傳導途徑，提高活性氧水平，啟動水楊酸和茉莉酸信號途徑，關閉氣孔，促細胞壁增厚等多種應答方式，提高自身對病原菌侵染的抵抗能力[7].病原菌為了能夠進一步侵染植株，會向植物細胞內分泌效應子(Effector)，抑制植物的PTI反應，減弱植物的抗病性，增強自身侵染能力[8].RxLR效應子對晚疫病的侵染具有重要貢獻，主要特征是N端含有一個15-25個疏水性氨基酸殘基組成的信號肽，信號肽后是保守的Arg-x-Leu-Arg(RxLR)結構域，除此之外還含有多樣且快速進化的C末端結構域[9].

在植物和病原菌共進化的過程中，植物進化出了第二道防線，稱為效應子引發(fā)的免疫反應(Effector-triggered immunity，ETI).在與晚疫病的長期斗爭中，植物進化出了含有核苷酸結合結構域(Nucleotide-binding domain，NB)和富含亮氨酸重復單元結構域(Leucine-rich repeat，LRR)的蛋白[10]，稱為NB-LRR類R(Resistance)蛋白，通過直接或間接的方式識別RxLR型效應子，進而觸發(fā)ETI，形成強烈的免疫反應，引起局部性的細胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)，這種反應也被稱為過敏反應(Hypersensitive response，HR)[11].過敏反應是植物防衛(wèi)反應的一種重要形式，在病原菌侵染的位置迅速導致一部分細胞壞死，阻止病原菌的進一步侵染[12].因此，分析致病疫霉侵染馬鈴薯時的效應子的表達情況并鑒定其中的保守效應子對于研究馬鈴薯抵御病原菌侵染的分子機制具有重要意義.

近年來，高通量測序技術在生物學研究上的應用越來越廣泛，轉錄組測序(RNA-seq)是利用高通量測序技術，將生物細胞或某個組織在特定時期表達的mRNA、sRNA以及非編碼RNA(ncRNA)進行全部測序分析，從而快速而全面的獲取該物種在特定時期的所有轉錄信息.得到轉錄組信息后可以進行基因表達水平分析、差異表達基因分析、差異表達基因GO分類以及差異表達基因聚類分析等，為后續(xù)的研究提供大量的基因信息，作為研究的參考和依據.本研究通過對4種致病疫霉生理小種侵染的馬鈴薯葉片進行轉錄組測序，鑒定得到277個保守的RxLR型效應子.此外，通過分析馬鈴薯響應致病疫霉侵染的差異表達基因，初步表明馬鈴薯對不同生理小種侵染的響應機制存在很大差異.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用的馬鈴薯品種為Desiree，保存于云南師范大學馬鈴薯科學研究院.材料種植于云南師范大學馬鈴薯育種試驗基地.

采用的致病疫霉生理小種由云南師范大學馬鈴薯科學研究院唐唯老師惠贈，分別采集于云南不同地區(qū)，編號為：124、SI、H6和88.保存于云南師范大學馬鈴薯科學研究院.

1.2 實驗試劑

RNAprep Pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒(DP441)購自北京天根生化科技有限公司.黑麥培養(yǎng)基參照文獻[13]進行了改進：60 g黑麥，加水煮沸2 h，用紗布過濾收集黑麥汁，加入20 g蔗糖，100 mL V8蔬菜汁，1 g CaCO3，13 g瓊脂粉，調節(jié)pH至7.0，定容為1 L.高溫高壓滅菌后將培養(yǎng)基傾倒于直徑9 cm的塑料培養(yǎng)皿中，用于培養(yǎng)致病疫霉.

1.3 實驗方法

1.3.1 游動孢子收集

挑取致病疫霉的菌絲接種到新配制的黑麥培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中，18 ℃黑暗培養(yǎng)14 d，選取菌絲生長旺盛，狀態(tài)良好的平板，加入適量無菌水，使用涂布棒輕輕地將孢子囊刮下來，收集孢子囊.在光學顯微鏡下觀察孢子囊數目，調整孢子囊濃度約為1 × 105個/mL，4 ℃靜置2～3 h，使孢子囊破裂，釋放出游動孢子，用于接種在馬鈴薯葉片上.

1.3.2 離體葉片接菌實驗

選取長勢健康且無機械損傷的Desiree葉片進行離體接菌實驗.吸取10 μL游動孢子懸浮液，接種于葉片背面，采用塑料薄膜封口，保持溫度為20 ℃，相對濕度為90%以上.接種48 h后，用打孔器取下病斑位置的葉片，立即液氮速凍保存，隨后用于提取RNA.

1.3.3 RNA提取

按照RNAprep Pure Plant Kit試劑盒說明書提取RNA，分別提取未接菌時的Desiree葉片和接菌48 h后的病斑位置葉片RNA，每個處理組和對照組各兩個重復.將提取得到的RNA送至安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司進行轉錄組測序.

1.3.4 轉錄組測序及分析

采用illumina Novaseq 6000 測序平臺對RNA樣品中的mRNA進行建庫測序.采用雙端測序，讀長150 bp，每個樣品過濾后得到的有效數據不少于8 Gb.

使用Hisat2(v2.1.0)將測序得到的結果分別比對到馬鈴薯和致病疫霉的參考基因組上[14].使用StringTie(v1.3.3b)計算每個基因的FPKM[15].使用ballgown(v2.16.0)計算病原菌處理前后基因表達水平差異[16]，以上這些軟件均使用默認參數運行.使用課題組編寫的Python腳本為基因添加注釋信息，用于后續(xù)的分析.使用Venny(v2.1)繪制基因表達的韋恩圖(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/).使用ComplexHeatmap(v2.0.0)繪制基因表達的熱圖[17].

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯葉片離體接菌

選取生長14 d的124、SI、88和H6致病疫霉，采用上述方法收集病原菌孢子囊，顯微鏡下觀察如圖所示(圖1 A).4 ℃靜置2～3 h后，釋放出游動孢子.采集Desiree材料生長狀況良好的葉片，放置于托盤內，吸取10 μL游動孢子接種到馬鈴薯葉片背面，使用塑料薄膜封口，48 h后產生明顯的發(fā)病癥狀(圖1 B和C).使用直徑6 mm的打孔器取下病斑部位的葉片，進行RNA的提取.將提取獲得的RNA交予測序公司進行mRNA轉錄組建庫測序.

A：從培養(yǎng)皿上收集的致病疫霉孢子囊;B：接菌前的Desiree葉片;C：接菌48 h后Desiree葉片的表型

圖1致病疫霉侵染前后Desiree葉片的表型

Fig.1The phenotypes of Desiree leaves before and after inoculation

2.2 致病疫霉侵染的轉錄組測序結果分析

2.2.1 致病疫霉轉錄組分析和保守RxLR效應子鑒定

使用Hisat2分別將124、SI、88、H6侵染48 h的測序數據比對回致病疫霉的參考基因組，獲得reads在基因組上的比對信息.使用StringTie計算基因的FPKM，計算2個重復樣品的平均FPKM作為轉錄本的表達量.使用課題組編寫的Python腳本為轉錄本添加注釋信息.

根據基因注釋信息和表達量，挑選注釋為RxLR且FPKM > 1的轉錄本作為在侵染過程中有表達的效應子.共鑒定到427個效應子在致病疫霉侵染過程中有表達，表明這些蛋白參與了抑制植物免疫反應的過程.其中124、88、SI和H6中分別有346，330，357和356個RxLR效應子表達.進一步分析表明，287個效應子在88和124中共有表達，88和H6共有的為298個，H6和SI共有的為316個，124和SI共有的為312個.在所有4種生理小種中共同表達的效應子為277個(圖2 A).這個結果說明，在不同的生理小種侵染馬鈴薯葉片時，會分泌大量不同的RxLR效應子進入植物細胞，從側面證實了致病疫霉生理小種的多樣性.這其中277個效應子在4個小種中均表達，意味著這些效應子在抑制植物免疫反應時具有比較保守的功能.

A：侵染48 h后，不同生理小種中效應子表達情況;B：不同生理小種保守效應子的表達水平

圖2不同致病疫霉生理小種中RxRL效應子的表達情況

Fig.2The expression of RxLR effectors in differentPhytophthorainfestansisolates

2.2.2 晚疫病菌RxLR型效應子表達水平分析

為了進一步分析保守效應子的表達水平，比較了277個保守效應子在不同病原菌中的表達量數據.使用ComplexHeatmap繪制基因表達的熱圖.結果顯示(圖2 B)，在4種生理小種中，共表達的效應子有著類似的表達模式：部分效應子在4種生理小種中表達量普遍較高(FPKM > 40)，而另一部分效應子在4種生理小種中表達量普遍偏低(FPKM < 10).這種不同生理小種基本一致的表達模式也進一步證實了這些效應子可能具有比較保守的生物學功能.

2.2.3 馬鈴薯響應致病疫霉侵染的差異表達基因分析

使用Hisat2將病原菌侵染前后的轉錄組測序結果比對回馬鈴薯參考基因組，使用StringTie計算轉錄本的FPKM作為轉錄本表達量，使用ballgown計算病原菌侵染前后的差異表達基因.挑選fold change≥2，P<0.05的基因作為響應病原菌侵染表達發(fā)生上調的基因；挑選fold change≤0.5，P<0.05的基因為下調表達基因.分別將124、SI、88和H6侵染后表達上調和下調的基因繪制韋恩圖.

結果顯示，4種生理小種侵染馬鈴薯48 h后，共有2 230個基因上調表達，2 556個基因下調表達(圖3).其中88和124侵染馬鈴薯葉片時，共同上調表達的基因有49個，共同下調表達的基因有70個；124和H6侵染馬鈴薯葉片時，有27個基因表達水平同時上調，22個基因表達下調；H6和SI侵染馬鈴薯葉片時，共同響應的基因有29個，其中上調表達的19個，下調表達的10個；SI和88侵染馬鈴薯葉片時，4個基因的表達同時上調，2個基因的表達下調.這些結果表明，只有少數基因能同時響應2種生理小種的侵染，沒有基因能同時響應4種生理小種的侵染；說明馬鈴薯在感受到不同病原菌侵染時，相應地調整了自身基因表達，進一步證明致病疫霉不同生理小種之間具有不同的侵染特性.

A：馬鈴薯響應病原菌侵染上調表達的基因；B：馬鈴薯響應病原菌侵染下調表達的基因

圖3馬鈴薯中響應致病疫霉侵染的差異表達基因

Fig.3Differentially expressed genes in potato in response toPhytophthorainfestansinfection

3 討 論

作為一種重要的塊莖類糧食作物，世界上約13億人以馬鈴薯作為主糧.威脅馬鈴薯生產最重要的病害之一是由致病疫霉所引起的馬鈴薯晚疫病.即使在近年，晚疫病依然嚴重威脅馬鈴薯的生產，2012年，甘肅省馬鈴薯晚疫病的爆發(fā)致使部分馬鈴薯產區(qū)絕收，大部分產區(qū)嚴重減產[18].

在晚疫病抗性研究中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列抗病基因(R基因).然而隨著晚疫病菌的快速進化，含有R基因的品種很快被克服.近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)對植物體內的感病基因(S基因)進行編輯，能夠使植物獲得對病原菌的廣譜抗性.Wang等[19]發(fā)現(xiàn)致病疫霉效應子Pi04089能夠與馬鈴薯細胞中的RNA結合蛋白StKRBP1相互作用，將StKRBP1過表達能顯著降低馬鈴薯的抗病性.相反對StKRBP1進行突變，阻斷其與Pi04089的互作后，顯著增強了馬鈴薯的抗病性.Boevink等[20]發(fā)現(xiàn)致病疫霉效應子Pi04314與宿主體內的PP1c互作，沉默PP1c基因后，馬鈴薯的抗病性顯著增強.表明PP1c作為一種S基因，抑制了植物的免疫反應.鑒定S基因的第一步就是要獲得致病疫霉中保守的效應子.2009年，致病疫霉參考基因組[21]的公布大大加快了這一進程.Brian等[21]研究發(fā)現(xiàn)，79個RxLR效應子在致病疫霉侵染馬鈴薯2～3 d后表達量顯著增高.Yin等[22]對5種致病疫霉菌株游動孢子侵染馬鈴薯葉片12 h后的材料進行了深度測序，共分析得到了245個RxLR效應子，其中108個在所有5種致病疫霉菌株都有表達，進行序列多態(tài)性分析后，得到了18個序列保守的RxLR效應子，進一步研究發(fā)現(xiàn)SF12、SFI3和SFI4在所有被測菌株中高表達，表明它們在侵染植物的早期階段具有潛在的重要功能.

研究通過高通量測序技術，分析了4種致病疫霉生理小種侵染后的馬鈴薯葉片轉錄組，共鑒定到427個RxLR效應子在病原菌侵染過程中表達，其中277個效應子在4個生理小種中均有表達(圖2 A).對這些效應子的基因表達水平進行分析，表明其在不同生理小種中具有類似的表達模式(圖2 B).這個結果為進一步尋找馬鈴薯中的保守S基因奠定了基礎.此外，還進一步分析了馬鈴薯響應致病疫霉侵染的差異表基因.共鑒定到2 230個基因在病原菌侵染時表達上調，2 556個基因表達下調.通過相互比較，發(fā)現(xiàn)不同生理小種所誘導的差異表達基因存在很大不同(圖3)，表明不同生理小種具有不同的侵染特性，使得馬鈴薯在應對病原菌侵染時表現(xiàn)出不同的基因表達模式，這也從側面說明了致病疫霉生理小種的多樣性以及研究馬鈴薯抵御致病疫霉侵染的復雜性和困難性.