黃文彬

（江蘇聯(lián)合職業(yè)技術學院鹽城生物工程分院，江蘇鹽城 224001）

柑桔青霉病和綠霉病是造成柑桔果實采后貯藏腐爛的主要病害，是由意大利青霉菌和指狀青霉菌侵染柑桔而引起的。每年由于感染以上2 種病菌而損失的柑桔果實達到30%～50%[1]。目前生產(chǎn)上廣泛使用咪鮮胺、甲基托布津、多菌靈等化學殺菌劑進行防治，由于化學保鮮劑的長期大量使用，造成藥物殘留，對人體健康以及柑桔果實的品質造成嚴重的影響。納他霉素是一種高效、廣譜的真菌抑制劑，主要應用于肉類、飲料、乳制品等食品中，能較好地抑制霉菌、酵母菌生長。目前將納他霉素應用在水果保鮮上的報道還很少，在柑桔[2]、草莓[3]、葡萄[4]、蘋果[5]上面有些初步研究。本試驗以引起柑桔采后青綠霉病的意大利青霉和指狀青霉為材料，研究不同濃度納他霉素對2 種青霉菌的抑制作用及毒力方程，確定最低抑菌濃度，旨在為研究納他霉素在果蔬保鮮中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種為意大利青霉（Penicillium italicum）、指狀青霉（P.digitatum），均購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心（ACCC），納他霉素（Natamycin）購于蘭州偉日生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

生化培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，超凈工作臺，電子天平，移液槍（0～1000μL）。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同濃度納他霉素對青霉菌的抑制效果評價。將納他霉素配制成100、150、200、300、400、500、600、700μg/mL 的濃度梯度。用接種環(huán)分別挑取少量培養(yǎng)3d 的意大利青霉和指狀青霉菌于裝玻璃珠的無菌生理鹽水三角瓶內(nèi)，振蕩10min 左右，制成均勻的菌懸浮液。血球計數(shù)板計數(shù)，使其含孢子為106～107CFU/mL左右，用移液槍向凝固的PDA 平板上加0.1mL 菌懸液，無菌三角玻璃刮鏟涂布均勻。鑷子夾無菌牛津杯，放置于菌液平板表面，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。用移液槍向牛津杯加0.2mL 不同濃度的納他霉素，勿使外溢。至26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察抑菌效果，測量抑菌圈直徑。

1.3.2 納他霉素對青霉菌的最低抑制濃度（MIC）。將納他霉素用2%冰醋酸配制成濃度分別為2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL。于含不同濃度藥液的試管中，各加入測試菌0.2mL，充分混勻，將上述試管置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h。取出試管，充分振蕩，并對各試管進行逐個檢查，用肉眼觀察其渾濁度。

1.3.3 菌懸液及菌餅的制備[6]。將供試菌于28℃馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上活化3d，用無菌水配制成106～107CFU/mL 的霉菌孢子懸浮液。取菌懸液0.2mL 接入已凝固的PDA 培養(yǎng)基上，涂布均勻。放入26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，用打孔器在菌落邊緣打出6mm 直徑的菌餅，待用。

1.3.4 納他霉素對青霉菌菌絲的生長抑制作用。采用室內(nèi)生長速率法[7]，測定納他霉素對指狀青霉菌和意大利青霉菌的毒力大小。

2 結果與分析

2.1 不同濃度納他霉素對青霉菌抑制效果評價

由表1 可知，不同濃度納他霉素對柑桔青霉均有良好的抑制效果，隨著濃度的不斷提高，抑菌圈直徑也隨之增大，500μg/mL 以后隨著濃度的增加，抑制效果差異不顯著，而且經(jīng)過試驗，濃度600μg/mL 和700μg/mL 浸泡臍橙時，表面會殘留有白色的藥斑，影響果實外觀，綜合考慮成本和抑制效果，推薦生產(chǎn)實踐的濃度為500μg/mL 為佳。

表1 納他霉素對意大利青霉和指狀青霉的抑制效果（96h）

2.2 納他霉素對青霉的最低抑制濃度（MIC）

表2 可知，納他霉素對意大利青霉和指狀青霉都有極強的抑制作用，隨著濃度的增加，其抑菌作用越明顯，兩者的最低抑制濃度相同，為6μg/mL。

2.3 納他霉素對柑桔青霉菌菌絲生長的抑制作用

表2 納他霉素對意大利青霉和指狀青霉的最低抑制濃度（72h）

采用室內(nèi)毒力測定法，在PDA 培養(yǎng)基上測定納他霉素對柑桔青霉菌菌絲的抑制作用，獲得不同濃度藥劑處理對菌落生長抑制作用數(shù)據(jù)，得出以各藥劑濃度對數(shù)值為X，抑菌率幾率值為Y 的毒力回歸方程和EC50，其結果見表3，納他霉素對意大利青霉菌的毒力作用較強，EC50 為0.6287μg/mL，對指狀青霉的毒力作用稍弱，EC50 為3.5319μg/mL。

表3 納他霉素對意大利青霉菌和指狀青霉菌的毒力回歸方程（72h）

3 討論

納他霉素作為一種高效、安全的生物保鮮劑，主要應用在食品工業(yè)上，在水果保鮮上的應用較少。本試驗研究表明，納他霉素對引起柑桔常見采后病害的青霉菌也具有較強抑制效果，明確了對意大利青霉和指狀青霉的最低抑制濃度。為今后在生產(chǎn)上的應用提供了理論依據(jù)。