姜 璘，付惠惠，王鳳月，鄧源林，高 飛，侯曉暉

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 細胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.中國科學(xué)院動物研究所 干細胞與生殖生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100020)

世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定，不育是至少有12個月以上的不避孕性生活史而仍未受孕[1]。男性不育不是一種獨立的疾病，而是由某一種或多種疾病與因素導(dǎo)致的后果[2]。除與男性不育直接相關(guān)的病理原因外，環(huán)境因素亦是主要原因之一，如環(huán)境污染物的暴露[3]。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，金屬錳的產(chǎn)品越來越多地進入到我們生活中，同時采礦、精煉、干電池生產(chǎn)、焊接等與錳相關(guān)的行業(yè)領(lǐng)域均可增加人類的錳暴露水平[4]。研究表明，錳具有雄性生殖毒性，表現(xiàn)為損害睪丸組織，降低精子數(shù)量及活力，誘導(dǎo)生殖細胞凋亡，改變酶活性，干擾生殖激素水平等[5]。早期組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，錳可致睪丸間質(zhì)水腫充血，曲細精管明顯受損，若染毒超過150d可見曲細精管變性，生精上皮脫離，損害隨時間推移而加重，且不可逆轉(zhuǎn)[6]。此外，染錳小鼠精子畸形率增高，以精子頭部畸形為主，精子活動能力逐漸降低，即使低水平錳對精子仍有毒性損害作用[7]。目前，臨床上應(yīng)用依地酸二鈉鈣(CaNa2EDTA)和對氨基水楊酸鈉(PAS-Na)治療環(huán)境污染物錳所帶來的生殖損傷，但長期使用EDTA可造成體內(nèi)微量元素丟失等副作用[8]。因此，需要尋找更安全有效的天然產(chǎn)物來保護男性生殖健康。

九香蟲是我國一種傳統(tǒng)的藥用昆蟲，中醫(yī)臨床上廣泛用于各種疼痛、陽痿等癥狀。《本草綱目》中記載：“九香蟲氣味咸溫、無毒，主治膈脘滯氣、脾腎虧損、壯元陽”。近年研究發(fā)現(xiàn)，九香蟲提取物具有明顯的抗疲勞和補腎壯陽作用[9]，如何志全等利用九香蟲干預(yù)錳暴露雄性大鼠的生殖器官損傷，其性行為、精子數(shù)、睪丸和附睪的臟器系數(shù)等指標(biāo)均有明顯改善，表明九香蟲對生殖器官損傷雄性大鼠的生殖功能具有一定的保護作用[10]。雖然九香蟲可用于改善環(huán)境污染物錳所導(dǎo)致的生殖損傷，但其保護機制尚不明確，需要進一步研究。本研究通過錳暴露建立雄性SD大鼠生殖器官損傷模型，同時利用九香蟲進行干預(yù)，通過檢測睪丸組織凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、CytC和C-Cas3的變化，探討九香蟲生殖保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 8周齡雄性SD大鼠50只，購于第三軍醫(yī)大學(xué)動物學(xué)實驗室[許可證號：SCXK(渝)2012-0005]。大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，12 h光照12 h黑暗交替，動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度在22～24℃，并且動物實驗嚴格按照動物倫理委員會的規(guī)定進行。

1.1.2 實驗試劑 九香蟲購于貴州省遵義市百頤醫(yī)藥公司。兔源Bcl-2單克隆抗體購于Abcam公司；兔源Bax、CytC和C-Cas3單克隆抗體購于CST公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔試劑盒購于Proteintech公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 九香蟲水提液 首先將干燥的九香蟲粉碎成末，再取0.2 kg九香蟲粉末加入1L蒸餾水煮沸30 min成水煎液，后者經(jīng)過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及冷凍干燥后，最后用滅菌的雙蒸水配制成相應(yīng)劑量(50、100、200 mg/kg)的九香蟲水提液。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備及九香蟲干預(yù) 按照隨機分組法，將50只8周齡雄性SD大鼠隨機分成5組(n=10)，即空白組(Control)、模型組(Mn)、九香蟲低(50CcE+Mn)、中(100CcE+Mn)、高(200CcE+Mn)劑量干預(yù)組。除了空白組大鼠腹腔注射1ml生理鹽水外，其余各組按照30 mg/kg體重腹腔注射7.5 mg/mL氯化錳溶液，連續(xù)2周、5天/周、1次/天建立生殖損傷模型；同時，空白組和模型組灌胃1 mL蒸餾水，而九香蟲低、中、高劑量干預(yù)組分別灌胃不同濃度(50、100、200 mg/kg)的九香蟲水提液，連續(xù)4周、7天/周、1次/天進行九香蟲干預(yù)。大鼠末次給藥后頸椎脫臼處死，立即取出睪丸，并檢視其是否有損傷，若無損傷，將一側(cè)睪丸保存于4%多聚甲醛溶液中固定后嵌入石蠟中，用于免疫組化及HE染色；另一側(cè)睪丸收集于EP管中保存于液氮中，用于WB檢測。

1.2.2 免疫組化檢測 按常規(guī)方法將石蠟切片進行脫蠟、脫水等步驟，并參照免疫組化試劑盒說明書進行操作，一抗為Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶50)、CytC(1∶50)和C-Cas3(1∶50)，二抗為山羊抗兔IgG(1∶200)。

1.2.3 Western blot檢測 按常規(guī)方法提取睪丸組織總蛋白，再進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、顯色等步驟，一抗為Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶2 000)、CytC(1∶2 000)和C-Cas3(1∶2 000)單克隆抗體及內(nèi)參GAPDH，二抗為HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體。采用 Image-Pro軟件分析，掃描出灰度值。

2 結(jié)果

2.1 睪丸組織HE染色 空白組睪丸曲細精管管腔大小基本一致、各級生精細胞有序排列于管壁上，著色均勻，支持細胞分布于生精細胞之間，細胞成群分布(見圖1A,F)。模型組與空白組比較：生精小管管腔變大，管壁變薄，生精小管之間間隙增大，基膜不完整，各級生精細胞排列紊亂、細胞界限模糊，生精上皮的細胞層次減少(見圖1B,G)。而經(jīng)過九香蟲干預(yù)后，睪丸組織結(jié)構(gòu)得到了明顯改善，生精小管管腔逐漸變小，基膜逐漸完整，生精上皮細胞層次逐漸增多(見圖1C-E,H-J)。

圖1 睪丸組織HE染色結(jié)果

2.2 九香蟲干預(yù)影響凋亡相關(guān)蛋白表達 免疫組化檢測凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL-2、C-CAS3和CYTC在睪丸的表達情況，如圖2所示，上述蛋白在空白組大鼠各級生精細胞中均有表達(見圖2A,F,K,P)，而模型組較空白組的表達有所變化(圖2B,G,L,Q)，但九香蟲干預(yù)組較模型組中各凋亡相關(guān)蛋白的表達量更接近于空白組，且隨著濃度升高而變化(見圖2C-E,H-J,M-O,R-T)。

圖2 九香蟲水提液對大鼠睪丸組織中BAX、BCL-2、C-CAS3和CYTC蛋白定位及表達的影響

Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL-2、C-CAS3和CYTC在各組大鼠睪丸中的變化情況。與空白組相比，模型組的BCL-2蛋白表達量減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而九香蟲干預(yù)組與模型組相比有一定程度的升高，尤其是中、高劑量組最為明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖3)。此外，模型組的BAX、CYTC和C-CAS3蛋白表達量較空白組均有所增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而九香蟲干預(yù)組較模型組有一定程度的降低，其中BAX高劑量組以及CYTC和C-CAS3各劑量組的蛋白表達量均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖3)。

與空白組相比## P<0.01；與模型組相比，* P<0.05，** P<0.01。圖3 九香蟲水提液對大鼠睪丸組織中BAX、BCL-2、CYTC和C-CAS3蛋白表達的影響

3 討論

自然環(huán)境中錳不能被生物降解，只能在各種形態(tài)之間發(fā)生轉(zhuǎn)化，其造成的環(huán)境污染很難被消除，因而其對人體產(chǎn)生的影響和危害已成為人們關(guān)注的熱點問題[11]。過量錳在大鼠睪丸細胞內(nèi)主要蓄積于可溶性組分和微粒體中，可導(dǎo)致細胞內(nèi)微量元素分布改變及巰基含量減少，這在錳的雄性生殖毒性方面具有重要意義[12]。睪丸對錳的敏感性極高，氯化錳可通過血睪屏障、損傷生精功能及抑制精子發(fā)生[13]。張先平等[14]研究發(fā)現(xiàn)染錳睪丸組織中P53高表達、Bcl-2低表達以及抗氧化能力的下降可能是大鼠生精細胞凋亡增加的重要原因之一；而何志全等[15]認為九香蟲對錳中毒雄性大鼠的生殖損傷具有修復(fù)作用，與提高睪丸組織和血清中SOD、T-AOC等活性有關(guān)，即抑制自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用；同時，付惠惠等[16]利用九香蟲飼料對染錳大鼠睪丸損傷進行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其阻抑凋亡發(fā)生可能與調(diào)節(jié)相關(guān)基因Bcl-2和Bax的表達有關(guān)。本研究在前人研究基礎(chǔ)上，對九香蟲干預(yù)錳中毒雄性大鼠生殖損傷中的可能機制進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)除了Bcl-2和Bax基因外，凋亡信號通路的其它關(guān)鍵基因CytC和Caspases3也發(fā)生相應(yīng)改變，且這些改變對睪丸生精細胞具有明顯的抗凋亡作用。因此，通過九香蟲干預(yù)后可以在一定程度上改善錳中毒造成的雄性大鼠生殖損傷并具有抑制睪丸細胞凋亡的作用。

細胞凋亡存在于多細胞生物的整個生命過程當(dāng)中，參與這些細胞凋亡過程的主要有4類蛋白分子，即凋亡蛋白酶(caspases)、銜接蛋白(adapter proteins)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)和凋亡抑制蛋白(IAPs)[17]。線粒體在細胞凋亡過程中起著重要作用，而CYTC從線粒體釋放到胞漿是細胞凋亡程序關(guān)鍵的一步[18]；同時，Bax和Bcl-2可形成異源二聚體，使凋亡受到抑制[19]；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族是一組能特異性的切割天冬氨酸殘基上的肽鍵，從而引起細胞凋亡的蛋白水解酶，是多細胞動物體內(nèi)所有凋亡蛋白中最主要、最核心的死亡執(zhí)行者，Caspase3是最經(jīng)常被激活的，激活后經(jīng)自行裂解或被動裂解為活動性小體，再重新結(jié)合成有凋亡活性的蛋白酶而發(fā)揮作用。在各種細胞的凋亡過程中，均發(fā)現(xiàn)有Caspase3被激活并發(fā)揮作用。Caspase3是主要的凋亡執(zhí)行者，它比其它Caspase家族成員顯示了更多更復(fù)雜的多樣活性[20]。Cleaved-Caspase3(C-Cas3)是Caspase3活化過程中經(jīng)過剪切產(chǎn)生的活性片段，其表達程度可反映Caspase3的活性和細胞凋亡情況[21]。本研究中各組大鼠睪丸中BCL-2、BAX 、CYTC和C-CAS3蛋白表達發(fā)生一系列改變，均提示九香蟲對錳中毒引起的大鼠睪丸損傷的修復(fù)作用可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達進而阻抑凋亡發(fā)生，以達到修復(fù)生殖損傷的作用。

綜上所述，九香蟲水提液修復(fù)錳致大鼠生殖損傷的機制可能與抑制Bax表達、提高Bcl-2表達，導(dǎo)致二者的異源二聚體增多有關(guān)；此外，上調(diào)Bcl-2表達可抑制CytC的表達增加，阻止線粒體凋亡信號的傳遞及其下游信號C-Cas3的低表達，進而抑制睪丸生精細胞凋亡。