魏 群，呂 丹，陳海凌

（1 福建省計(jì)量科學(xué)研究院，福建 福州 350003）

（2 人民解放軍91370部隊(duì)，福建 福州 350015）

1 概述

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀（Polymerase Chain Reaction Analyzer,簡(jiǎn)稱“PCR儀”）可提供制定的溫度場(chǎng)，在該環(huán)境下DNA聚合酶發(fā)生復(fù)制進(jìn)行擴(kuò)增[1]。PCR技術(shù)具有極高的檢測(cè)靈敏度和特異性，可廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)等的診斷和療效觀察，在器官移植的基因配型上作用是難以替代的。目前市場(chǎng)上的PCR儀有梯度PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、原位PCR儀和定性PCR儀等。常規(guī)的多通道溫度檢測(cè)方法，比如帶熱電偶或帶熱電阻傳感器的溫度巡檢儀，在（0～100）℃測(cè)溫范圍內(nèi)的最大示值誤差能達(dá)到±0.3℃。但此類測(cè)溫儀器由于傳感器的結(jié)構(gòu)與擴(kuò)增儀孔板不能完全緊密接觸，導(dǎo)致測(cè)溫結(jié)果的準(zhǔn)確度不能滿足校準(zhǔn)要求[2]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀的溫度計(jì)量還處于起步階段，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的專業(yè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析儀溫度校準(zhǔn)裝置還是空白，各計(jì)量檢測(cè)單位多采用溫度巡檢儀或國(guó)外的檢測(cè)系統(tǒng)，如荷蘭Driftcon公司的無(wú)線PCR儀溫度校驗(yàn)系統(tǒng)和美國(guó)OPULUS公司的溫度巡回檢測(cè)裝置等。這些檢測(cè)裝置也存在一些問(wèn)題。

（1）現(xiàn)有裝置所配置的傳感器只可適用于固定形狀的PCR儀，或通道數(shù)固定，無(wú)法滿足各類PCR儀的多樣校準(zhǔn)需求。

（2）某些裝置是采用傳統(tǒng)的溫度巡回檢測(cè)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)溫度測(cè)量，多通道測(cè)量時(shí)每通道的數(shù)據(jù)采樣時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法反應(yīng)PCR儀的實(shí)時(shí)溫度，也就無(wú)法實(shí)現(xiàn)溫度超調(diào)和升降溫速率的功能。

（3）價(jià)格昂貴，國(guó)外設(shè)備多在（30-40）萬(wàn)/套。

2 PCR儀自動(dòng)校準(zhǔn)裝置的設(shè)計(jì)需求

2015年，原國(guó)家質(zhì)檢總局正式發(fā)布了JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》[3]，該規(guī)范推薦了使用的測(cè)溫點(diǎn)布置方式（15點(diǎn)校準(zhǔn)與位置分布，如圖1所示）、校準(zhǔn)設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、軟件溫控程序數(shù)據(jù)讀取的基本順序、誤差計(jì)算與校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)方式等。

圖1 15點(diǎn)校準(zhǔn)位置布點(diǎn)

因此，根據(jù)JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》和PCR儀校準(zhǔn)裝置的存在問(wèn)題，文中認(rèn)為可以從以下三方面進(jìn)行方案改進(jìn)。

（1）設(shè)計(jì)一套專用自動(dòng)化裝置，配置觸摸屏，支持至少15通道的高精度溫度傳感器的實(shí)時(shí)顯示和記錄、分析、處理；

（2）信號(hào)高速傳輸，每路數(shù)據(jù)采樣頻率大于2次/秒；

（3）設(shè)計(jì)一套自動(dòng)校準(zhǔn)軟件系統(tǒng)，包括數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)報(bào)表等功能，數(shù)據(jù)采集將終端數(shù)據(jù)采集至上位機(jī)，數(shù)據(jù)處理包括溫度示值誤差、溫度均勻性、升降溫速率等，數(shù)據(jù)報(bào)表包括聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)原始記錄的所有內(nèi)容。

3 PCR儀自動(dòng)校準(zhǔn)裝置的設(shè)計(jì)

PCR儀自動(dòng)校準(zhǔn)裝置需采集多路溫度傳感器信號(hào)，顯示并處理相關(guān)數(shù)據(jù)，總體框架如圖2所示。多路溫度傳感器采用熱敏電阻，采集PCR儀不同位置反應(yīng)孔的溫度信號(hào)，由片通電路實(shí)現(xiàn)各傳感器的選通，每個(gè)傳感器采樣速率不小于2次/秒；溫度信號(hào)經(jīng)過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換模塊由電阻信號(hào)轉(zhuǎn)換為電壓信號(hào)，并經(jīng)過(guò)A/D轉(zhuǎn)換進(jìn)入MCU處理；MCU在觸摸屏顯示實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)以及處理結(jié)果等，并可通過(guò)外擴(kuò)輸出數(shù)據(jù)；由按鍵控制裝置的開(kāi)啟與關(guān)閉；由電源模塊為傳感器、MCU、觸摸屏、外擴(kuò)等供電，其未在圖中畫出；測(cè)試完成后，可由外擴(kuò)設(shè)備將數(shù)據(jù)發(fā)至上位機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理等。

圖2 硬件框架圖

3.1 微處理器MCU

微處理器采用意法STM32F4系列，具有如下優(yōu)點(diǎn)：集成ARM Cortex-M4內(nèi)核，主頻180MHz，高達(dá)2MB的片上雙庫(kù)Flash存儲(chǔ)器，具有突出的高性能、高速數(shù)據(jù)傳輸能力和豐富的外部器件擴(kuò)展和通信總線，以及杰出的能耗效率，適用于電池供電情況。

3.2 溫度傳感器

溫度傳感器采用熱敏電阻，具有體積小、靈敏度高、反應(yīng)速度快、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)在于非線性，而文中采用的核心控制芯片提供大容量的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)空間，可完整記錄該溫度-阻值對(duì)應(yīng)表，因此選擇熱敏電阻作為測(cè)溫元件。

3.3 片選模塊

利用移位寄存器74HC595級(jí)聯(lián)電路來(lái)實(shí)現(xiàn)傳感器選通設(shè)計(jì)，如圖3所示。74HC595是一個(gè)8位串行輸入、可串行或并行輸出的移位寄存器存儲(chǔ)寄存器和三態(tài)輸出。該設(shè)備具有串行輸入（DS）和串行輸出（Q7）來(lái)級(jí)聯(lián)和異步復(fù)位輸入的功能。在移位寄存器時(shí)鐘（SHCP）上升沿時(shí)，DS上的數(shù)據(jù)會(huì)被移入移位寄存器，在存儲(chǔ)寄存器時(shí)鐘（STCP）上升沿時(shí)，移位寄存器里的數(shù)據(jù)傳輸?shù)酱鎯?chǔ)寄存器，當(dāng)輸出使能OE為低時(shí)，存儲(chǔ)寄存器里的數(shù)據(jù)就會(huì)并行輸出。

圖3 片選電路

3.4 外擴(kuò)模塊

文中數(shù)據(jù)外擴(kuò)采用WiFi和USB兩種模式。

WiFi利用ESP-12F WiFi模塊實(shí)現(xiàn)，該模塊支持標(biāo)準(zhǔn)的IEEE802.11 b/g/n協(xié)議，完整的 TCP/IP協(xié)議棧。用戶可以使用該模塊為現(xiàn)有的設(shè)備添加聯(lián)網(wǎng)功能，也可以構(gòu)建獨(dú)立的網(wǎng)絡(luò)控制器。內(nèi)置Tensilica L106超低功耗32位微型MCU，主頻支持80MHz和160MHz，支持RTOS。深度睡眠保持電流為10uA，關(guān)斷電流小于5uA，2ms之內(nèi)喚醒、連接并傳遞數(shù)據(jù)包。待機(jī)狀態(tài)消耗功率小于1.0mW。電路連接圖如圖4所示。

圖4 WiFi電路連接圖

另設(shè)USB輸出，電路如圖5所示。

圖5 15 USB輸出電路

3.5 自動(dòng)校準(zhǔn)軟件

校準(zhǔn)數(shù)據(jù)可通過(guò)外擴(kuò)設(shè)備發(fā)至上位機(jī)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理等，軟件界面如圖6所示，用彩色線條描繪多通道溫度實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，直觀反映被校PCR儀的實(shí)時(shí)波動(dòng)情況。

圖6 軟件界面

4 試驗(yàn)驗(yàn)證

文中采用PCR儀自動(dòng)檢定裝置校準(zhǔn)某品牌PCR儀，根據(jù)JJF 1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》設(shè)置采樣點(diǎn)和升降溫程序等，測(cè)量結(jié)果如表1所示，測(cè)試結(jié)果符合預(yù)期。

表1 測(cè)試結(jié)果

5 結(jié)論

目前PCR儀檢定過(guò)程中存在一些問(wèn)題：數(shù)據(jù)采樣時(shí)間長(zhǎng)，傳感器無(wú)法準(zhǔn)確反應(yīng)PCR儀實(shí)際工作情況；價(jià)格昂貴且模式固定，無(wú)論從價(jià)格還是實(shí)用性兩方面都不適用于國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的PCR儀校準(zhǔn)。因此，文中針對(duì)這些存在的問(wèn)題提出PCR儀校準(zhǔn)裝置的設(shè)計(jì)方案，并介紹了硬件實(shí)施方案，通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證可以發(fā)現(xiàn)該裝置的設(shè)計(jì)符合預(yù)期。