王志浩,顏 碩,王昱瓔,劉寶濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109)

大腸桿菌(Escherichia coli),是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、埃希菌屬(Escherichia)的代表菌[1]。雞大腸桿菌病是由大腸桿菌(E.coli)中的某些致病性菌株所導(dǎo)致的多種疾病的總稱,多采用抗生素類藥物治療[2]?？咕幊Ｔ讷F醫(yī)臨床中疾病的治療、預(yù)防與促進(jìn)生長等方面使用,由于長期使用抗生素,使得動物正常菌群的耐藥率不斷上升[3]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)主要產(chǎn)生于大腸桿菌和克雷伯氏菌屬,可水解3 代頭孢菌素和單環(huán)酰胺酶類藥物,并被BIA 抑制劑(如舒巴坦)所抑制[4]。ESBLs 根據(jù)基因同源性的不同,目前可分為5 類：TEM 型、SHV 型、CTX-M 型、OXA 型和其他類型等[5-6],目前我國主要流行型為CTX-M 型。磷霉素主要用于治療人金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等引起的軟組織感染和單純性尿路感染。Bartoloni[7]等在南美地區(qū)分離得到170 株大腸桿菌,其磷霉素耐藥率為98.2%,由于磷霉素在我國臨床應(yīng)用時間相對國外較短,目前對獸醫(yī)領(lǐng)域磷霉素及其耐藥基因流行性的相關(guān)報道較少。本研究調(diào)查了山東地區(qū)雞源大腸桿菌的耐藥情況及ESBLs和磷霉素耐藥基因的攜帶情況,為雞臨床用藥提供科學(xué)依據(jù),也為預(yù)防和減少耐藥的出現(xiàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 2015-2016 年在山東青島、臨沂、威海、煙臺、濰坊等各個地區(qū)的養(yǎng)殖場、活禽交易市場采集雞泄殖腔拭子336 份。

1.2 主要試劑 細(xì)菌生化微量鑒定管,購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;Taq 酶、Marker,購自TaKaRa 試劑公司;頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻呋(CTF)、氨芐西林(AMP)、氟苯尼考(FFL)、多西環(huán)素(DOX)、四環(huán)素(TET)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、鏈霉素(STR)、環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、左氧氟沙星(LEV)、萘啶酸(NAL)和磷霉素(FOS)等藥敏試驗藥物,購自上海麥克林試劑公司;麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、LB 瓊脂和LB 肉湯,購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 細(xì)菌的分離鑒定 將樣品接種于LB 肉湯,培養(yǎng)過夜。并接種于麥康凱瓊脂,放入恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h,并進(jìn)行純化;挑取純化后的可疑單菌落進(jìn)行革蘭染色和生化鑒定。

1.4 藥敏試驗 按照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI,2015)規(guī)定的瓊脂稀釋法測定菌株對14 種抗菌藥的敏感性,并根據(jù)CLSI 中耐藥折點進(jìn)行耐藥判讀。

1.5 ESBLs 基因型及磷霉素耐藥基因檢測 通過水煮法提取DNA,根據(jù)Liu[8]報道的blaCTX-M-1G引物序列,Bri?as[9]報道的blaCTX-M-9G引物序列和Hou[10]報道的磷霉素耐藥基因fosA3、fosC2 和fosA及PCR反應(yīng)體系進(jìn)行耐藥基因檢測：水18.375 μL,PCR Buffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,上下游引物各0.5 μL,模板DNA 1 μL,Taq0.125 μL。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min,(95 ℃,30 s+55 ℃,30 s+72 ℃,30 s)×30 個循環(huán),再延伸5 min。擴(kuò)增完畢后用1%瓊脂糖電泳,在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結(jié)果。經(jīng)電泳鑒定的PCR 產(chǎn)物送至華大基因科技服務(wù)有限公司測序,并進(jìn)行序列同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果 采集的336 個泄殖腔拭子中,經(jīng)鑒定共獲得336 株大腸桿菌,其中蛋雞源153 株,肉雞源183 株。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 336 株大腸桿菌對四環(huán)素、氨芐西林和多西環(huán)素的耐藥率較高,均達(dá)到78%以上,分別為85.4%、82.7%和78.6%,其余依次是萘啶酸(72.6%)、氟苯尼考(67.0%)、鏈霉素(56.0%)、恩諾沙星(50.0%)、頭孢噻肟(44.9%)、卡那霉素(40.2%)、頭孢噻呋(38.4%)、環(huán)丙沙星(37.8%)、慶大霉素(25.6%)、左氧氟沙星(26.8%)和磷霉素(28.7%)。336 株大腸桿菌中,肉雞源大腸桿菌對除氟苯尼考外的13種藥物的耐藥率均顯著高于蛋雞源大腸桿菌的耐藥率(P＜0.05),詳見圖1。

圖1 不同來源雞源大腸桿菌對14 種抗菌藥物的耐藥率

2.3 ESBLs 基因及磷霉素耐藥基因PCR 結(jié)果 在336 株大腸桿菌中,123 株(36.6%)攜帶blaCTX-M型ESBLs,攜帶率最高的為blaCTX-M-9G(24.1%,81 株),其次為blaCTX-M-1G(15.5%,52 株),其中10 株同時攜帶blaCTX-M-9G和blaCTX-M-1G基因,其他基因型ESBLs均未檢測出。在肉雞源大腸桿菌中blaCTX-M-9G攜帶率為33.9%,blaCTX-M-1G攜帶率為20.8%,其中包括10 株同時攜帶blaCTX-M-9G和blaCTX-M-1G基因的菌株;蛋雞源大腸桿菌中blaCTX-M-9G攜帶率為12.4%,blaCTX-M-1G為9.2%;值得注意的是,肉雞源大腸桿菌CTX-M 型ESBLs 攜帶率(49.2%)顯著高于蛋雞源大腸桿菌CTX-M 型ESBLs 攜帶率(21.6%)(P＜0.01),具體見表1。336 株大腸桿菌中fosA3 基因攜帶率為21.7%,fosA和fosC2 均未檢測出,并發(fā)現(xiàn)肉雞源大腸桿菌fosA3 檢出率(27.9%),顯著高于蛋雞源大腸桿菌fosA3 的檢出率(14.4%)(P＜0.01),具體見表2。值得注意的是,在123 株產(chǎn)CTX-M 型ESBLs大腸桿菌中,有66 株(53.7%)同時攜帶fosA3,顯著高于非產(chǎn)ESBLs 大腸桿菌中fosA3 的攜帶率

(3.3%)(P＜0.01)。

表1 336 株大腸桿菌中ESBLs 基因檢測結(jié)果

表2 336 株大腸桿菌中磷霉素耐藥基因結(jié)果

3 討論

大腸桿菌是人和動物體內(nèi)腸道的共生菌,可作為一些可轉(zhuǎn)移耐藥質(zhì)粒的重要儲存庫[11]。在各種可移動元件攜帶的耐藥基因中,ESBLs 能水解作為目前人類臨床和獸醫(yī)臨床的常用藥和關(guān)鍵藥的第三、第四代頭孢菌素,它的出現(xiàn)和散播引起了廣泛注意[12]。其中從豬肛門內(nèi)和禽泄殖腔中分離到的產(chǎn)ESBLs 大腸桿菌報道較多,產(chǎn)ESBLs 菌株不僅對氟喹諾酮類、頭孢菌素類藥物表現(xiàn)出較高耐藥率而且對多種抗菌藥均表現(xiàn)出交叉耐藥和多重耐藥[13]。當(dāng)今,產(chǎn)ESBLs 的大腸桿菌不斷增多,耐藥日益嚴(yán)重,其已成為人類研究的重要課題。磷霉素主要用于治療金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌等引起的軟組織感染和單純性尿路感染,目前未用于動物疾病的治療,但是雞源大腸桿菌內(nèi)卻存在磷霉素耐藥基因,因此對雞源大腸桿菌進(jìn)行磷霉素耐藥基因調(diào)查格外重要。

隨著養(yǎng)禽業(yè)不斷發(fā)展,禽源大腸桿菌的耐藥率與日俱增。本試驗對山東地區(qū)雞源大腸,桿菌對14種常用抗菌藥進(jìn)行耐藥檢測,結(jié)果表明,山東地區(qū)雞源大腸桿菌對氨芐西林、氟苯尼考、多西環(huán)素、四環(huán)素和萘啶酸的耐藥率均在67%以上,對頭孢菌素類藥物的耐藥率已經(jīng)高達(dá)38.4%～44.9%;對氟喹諾酮類藥物的耐藥率在26.8%～50.0%。王慧真[14]等報道的河北地區(qū)雞源大腸桿菌對頭孢菌素類藥物耐藥率為41%～70%,氟喹諾酮類為58%～70%,氨基糖苷類為33%～70%;李赫[15]報道的遼寧省盤錦地區(qū)動物源大腸桿菌對頭孢菌素類藥物耐藥率為37%～52%,喹諾酮類為33%～89%,氨基糖苷類為48%～89%;本試驗結(jié)果與其他地區(qū)這些已有報道相一致,表明我國禽源大腸桿菌耐藥十分嚴(yán)重。2013 年,Hou[16]等將從廣東養(yǎng)殖場分離的892 株雞源大腸桿菌進(jìn)行磷霉素耐藥率檢測,其耐藥率為1.3%,顯著低于本研究2015-2016 年的雞源大腸桿菌的耐藥率(28.7%),這說明磷霉素耐藥在近年來呈上升趨勢。本研究發(fā)現(xiàn),蛋雞源大腸桿菌對各種藥物(氟苯尼考除外)的耐藥率均顯著低于肉雞源大腸桿菌的耐藥率,分析其原因可能是由于肉雞的養(yǎng)殖周期短密度大,易發(fā)生細(xì)菌性疾病,使肉雞飼養(yǎng)中抗菌藥的使用劑量及頻率明顯高于蛋雞所致。因此,肉禽生產(chǎn)中抗菌藥使用的監(jiān)管力度亟待加強(qiáng)。

ESBLs 基因型中最早報道的為TEM 型,但在近年來國內(nèi)外報道的動物源大腸桿菌中ESBLs 的主要流行型為CTX-M 型[17],如香港Ho[11]等和英國Horton[18]等報道的動物源產(chǎn)ESBLs 大腸桿菌中,CTX-M 型的攜帶率均超過90%。我國謝榕[19]等報道在河北地區(qū)雞源大腸桿菌中CTX-M 型ESBLs 的攜帶率為66.3%,劉保光等[20]報道鴨源大腸桿菌ESBLs 的檢出率為33.0%,本研究在山東地區(qū)檢測CTX-M 型ESBLs 攜帶率為36.6%。這說明在不同地區(qū)和不同動物源大腸桿菌中產(chǎn)ESBLs 的陽性率存在差異。Hou[16]等將從廣東養(yǎng)殖場分離的892株雞源大腸桿菌進(jìn)行磷霉素耐藥率檢測,最終得到12 株(1.3%)耐磷霉素大腸桿菌,其中10 株存在fosA3 基因(1.1%);本研究中336 株大腸桿菌中fo-sA3 基因攜帶率為21.7%,明顯高于廣東地區(qū),其可能原因為本研究所用菌株分離自2015-2016 年且隨著年代的變化磷霉素耐藥發(fā)生擴(kuò)散導(dǎo)致。研究還發(fā)現(xiàn)fosA3 基因?qū)α酌顾氐哪退幝势鹬匾獩Q定作用。本研究顯示,山東地區(qū)肉雞源大腸桿菌中fosA3和CTX-M 型ESBLs 的檢出率均顯著高于蛋雞源大腸桿菌(P＜0.01),其原因可能為肉禽養(yǎng)殖規(guī)模大,養(yǎng)殖時間短,為防止疾病的發(fā)生而使用抗生素造成的。值得注意的是,fosA3 在產(chǎn)CTX-M 型ESBLs 大腸桿菌中的攜帶率(53.7%)顯著高于非產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中的攜帶率(3.3%)(P＜0.01),這說明fosA3 與CTX-M 型ESBLs 聯(lián)系密切,且隨著頭孢菌素類藥物在養(yǎng)禽中的應(yīng)用可促進(jìn)磷霉素耐藥的傳播。近年來,由產(chǎn)ESBLs 的腸桿菌和氟喹諾酮耐藥大腸桿菌引起的人尿路感染越來越多,這使磷霉素這一“老藥”成為治療該感染的有效藥物。獸醫(yī)臨床使用廣譜抗生素,產(chǎn)生的攜帶ESBLs 和磷霉素耐藥基因的菌株會通過直接接觸或食物鏈等方式進(jìn)入人體,給尿路感染的治療等帶來巨大難題,對此我們應(yīng)給予重視。本研究獲得的耐藥率和耐藥基因結(jié)果,可為養(yǎng)雞場細(xì)菌性疾病的用藥提供理論指導(dǎo)。