李鑫鑫,張廣芳,呂其壯,張彥明,郭抗抗

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西 楊凌 712100)

豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)和豬呼吸道綜合征(PRBC)多種疾病的主要病原之一[1]。PCV2 會引起豬的免疫抑制、混合感染和繼發(fā)感染,使養(yǎng)殖戶遭受巨大經(jīng)濟損失[2]。近些年來,通過疫苗免疫接種是防控PCV2 相關疾病的有效方法,但還不能完全阻止病毒的感染[3],因此,闡明PCV2 致病機理對本病的防控具有重要的指導作用。

研究表明,PCV2 在感染細胞中可以促進細胞的凋亡,軟件預測其存在11 個開放閱讀框(Open reading frame,ORF),理論上可以編碼11 個產(chǎn)物。其中,ORF3 編碼產(chǎn)物可以誘導宿主細胞的凋亡,這種作用可能有利于病毒在動物體內(nèi)的增值,在PCV2 感染和致病中發(fā)揮重要作用[4-6]。

目前,臨床常用的檢測PCV2 抗體的方法仍是ELISA,此方法操作簡單、快速,易于標準化,適合臨床上檢測大量樣品[5]。因此,本試驗制備ORF3 蛋白抗體,并建立了基于ORF3 蛋白的PCV2 抗體檢測間接ELISA 方法,為ORF3 抗體檢測和鑒定提供了方法,也可以用于PCV2 感染和疫苗免疫豬抗體的檢測。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株、抗體與主要試劑 PCV2 楊凌分離株由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)公共衛(wèi)生學實驗室(本實驗室)分離保存;TaqDNA 聚合酶、IPTG,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA 膠回收試劑盒、PCR 試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;原核表達載體pGEX-6p-1、大腸埃希菌(E.coli)DH5α 和BL21 感受態(tài)細胞、T4 DNA 連接酶、DNA Marker DL-5 000 和蛋白Marker,均為寶生物工程有限公司(TakaRa 大連)產(chǎn)品;GST 標簽抗體和羊抗鼠二抗,購自上海三箭生物技術有限公司;辣根過氧化物酶標記羊抗豬血清系晶彩生物科技公司產(chǎn)品;豬圓環(huán)病毒ELISA 檢測試劑盒為上海谷研實業(yè)有限公司產(chǎn)品;所用陰陽性血清均由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院畜禽疫病防控與獸醫(yī)公共衛(wèi)生實驗室保存;豬瘟病毒(CSFV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性血清,均由本實驗室鑒定并提供。

1.2 引物設計與基因克隆 由PCV2 楊凌分離株全基因測序結果、GenBank 中PCV2 ORF3 序列設計特異性引物,其序列如下：

FP：5′-GCGAATTCATGGTAACCATCCCACCACTTG-3′

RP：5′-GCGAATTCATGGTAACCATCCCACCACTTG-3′。

PCR 條件為：95 ℃5 min;94 ℃30 s,60 ℃30 s,72 ℃30 s,共35 個循環(huán);72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物用12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳并純化回收。

1.3 重組質粒pGEX-6p-ORF3 的構建 純化回收的PCR 產(chǎn)物和pGEX-6p-1 空載體連接以構建重組質粒,轉入E.coliDH5α,篩選陽性菌落擴大培養(yǎng)后提取質粒。提取的質粒進行雙酶切后送北京六合華大基因科技有限公司測序分析,測序正確的重組質粒命名為pGEX-6p-ORF3。

1.4 重組質粒的誘導表達和蛋白純化 重組質粒與空質粒共同導入BL21 感受態(tài)菌株中,篩選得到陽性菌落并擴大培養(yǎng)后加入IPTG,對不同誘導時間的菌體蛋白進行SDS-PAGE 鑒定以確定最適表達時間。

將得到的菌體蛋白用切膠法進行純化,純化目的蛋白的樣品進行Western Blot 鑒定,確定是否得到重組ORF3 蛋白。

1.5 豬圓環(huán)病毒2 型抗體檢測間接ELISA 方法的建立

1.5.1 ORF3 蛋白包被濃度與血清稀釋度的確定 采用棋盤滴定的方法,將已純化的重組蛋白抗原用0.06 mol/L CBS 包被液按照1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL 梯度稀釋包被酶標板。酶標板4 ℃過夜后加入按照1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋的PCV2 陰陽性血清作為一抗孵育、辣根過氧化物酶標記羊抗豬血清作為二抗孵育,進行ELISA。比較血清OD450值,確定重組抗原最佳包被濃度與血清稀釋度。

1.5.2 封閉液的選擇 以重組蛋白抗原最佳包被濃度包被酶標板并分成兩組,一組加入10% PBS 的PBST,另一組加入25 g/L 脫脂奶粉的PBST。酶標板37 ℃封閉1h 后加入最佳稀釋度的陰陽性血清作為一抗,孵育洗滌后加入酶標二抗進行ELISA。重復兩次后比較陰陽性血清OD450值及P/N 值,確定最佳封閉液。

1.5.3 血清最佳反應時間的確定 以抗原最佳包被濃度與抗原最佳包被條件,加入最佳封閉液和一抗陰陽性血清,37 ℃條件下分別反應0.5 h、1 h、1.5 h,洗滌后加入酶標二抗進行ELISA,最后比較陰陽性血清OD450值及P/N 值,確定一抗血清最佳反應時間。

1.5.4 顯色時間的確定 按如上已確定的反應條件,加入底物后分別顯色5 min、10 min、15 min。比較陰陽性血清OD450值及P/N 值,最終確定最佳顯色時間。

1.5.5 間接ELISA 陰陽性臨界值的確定 將30 份經(jīng)檢測為PCV2 核酸和抗體陰性的豬血清用建立的間接ELISA 方法進行檢測,重復2 次,計算30 份血清OD450值的平均值和標準方差(SD),根據(jù)公式：臨界值=X+3SD,計算出陰陽性血清的臨界值。根據(jù)統(tǒng)計學規(guī)則,當血清OD450＞臨界值時,可判定為陽性。

1.5.6 特異性試驗 用建立的包被ORF3 蛋白的檢測PCV2 抗體的間接ELISA 方法分別檢測CSFV、PRV、JEV、PRRSV 的陽性血清,同時設PCV2 抗體陽性、陰性對照,判斷方法的特異性。

1.5.7 臨床血清樣品檢測 對豬場收集的80 份血清,用建立的方法進行PCV2 抗體檢測,同時用商品化試劑盒進行對照檢測,對檢測結果進行比較。

2 結果

2.1 豬圓環(huán)病毒2 型ORF3 蛋白的原核表達與純化

2.1.1 目的基因的擴增 PCR 結果顯示,擴增出的片段大小在300 bp 左右(圖1),符合預期。對目的產(chǎn)物進行純化回收后,序列測定表明片段大小為

315 bp,未發(fā)現(xiàn)突變、缺失現(xiàn)象。

圖1 ORF3 基因的PCR 擴增

2.1.2 重組質粒的鑒定與表達 重組質粒pGEX-6p-ORF3 測序結果顯示,插入的ORF3 基因完全正確,未出現(xiàn)堿基變化,可用于進一步的產(chǎn)物表達。IPTG 誘導表達確定最適時間后SDS-PAGE 電泳結果顯示,重組ORF3 蛋白大小為37 kDa,在37 ℃,225 r/min,IPTG 1.0 mmol/L 誘導5 h 時表達量最大(圖2)。

圖2 重組質粒表達產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析

2.1.3 GST-ORF3 重組蛋白純化的鑒定 純化回收的重組蛋白經(jīng)SDA-PAGE 電泳,可見到在37 kDa 左右處出現(xiàn)單一的條帶(圖3);Western Blot 分析,出現(xiàn)2 條特異性條帶,大小分別為26 kDa 和37 kDa(圖4),純化蛋白大于空載體。表明ORF3 基因得到了表達,經(jīng)切膠法得到了純化蛋白,測定純化蛋白的濃度為10.08 μg/mL。

圖3 GST-ORF3 蛋白純化的SDS-PAGE 分析

圖4 Western Bolt 對純化的GST-ORF3 蛋白的檢驗

2.2 豬圓環(huán)病毒2 型抗體間接ELISA 方法的建立與應用

2.2.1 抗原最佳包被濃度和血清稀釋度的確定采用棋盤滴定的方法,將已純化的重組蛋白抗原梯度稀釋,4 ℃包被過夜,加入按照1∶40、1∶80、1∶160、1∶320 稀釋的陰陽性血清進行ELISA。比較不同包被液濃度和不同血清稀釋度下OD450值(表1),可知抗原的最佳包被濃度為2 μg/mL,血清的最佳稀釋度為1∶160。

2.2.2 封閉液的選擇 分別用10% PBS 的PBST、25 g/L 脫脂奶粉的PBST 2 種封閉液對已用抗原包被的酶標板進行封閉,加入最佳稀釋度的陰陽性血清,進行ELISA 且重復2 次。比較陰陽性血清OD450值及P/N 值(表2),確定最佳封閉液為10%PBS 的PBST。

表1 重組ORF3 蛋白抗原最佳包被濃度和血清稀釋度的確定

表2 封閉液的確定

2.2.3 血清最佳反應時間的確定 以抗原最佳包被濃度與抗原最佳包被條件,加入封閉液和一抗血清,進行ELISA 且重復2 次。比較陰陽性血清OD450值及P/N 值(表3),確定一抗血清最佳反應時間為1 h。

2.2.4 顯色時間的確定 按已確定的反應條件,加入底物后,分別顯色5 min、10 min、15 min,重復2次。比較陰陽性血清OD450值及P/N 值(表4),確定最佳顯色時間為15 min。

2.2.5 間接ELISA 陰陽性臨界值的確定 將30份經(jīng)檢測為PCV2 核酸和抗體陰性的豬血清用已建立的間接ELISA 方法進行檢測,結果見表5。計算得到30 份陰性血清的OD450平均值為0.239,標準差(SD)為0.063,臨界值為0.428。因此,當待檢血清的OD450值＞0.43 時,可判為陽性;若待檢血清的OD450值＜0.43,則判為陰性。

表3 血清最佳反應時間的確定

表4 最佳顯色時間的確定

表5 間接ELISA 陰陽性臨界值的確定

2.2.6 特異性試驗結果 用建立的間接ELISA 方法分別檢測CSFV、PRV、JEV、PRRSV 的陽性血清,同時設陽性、陰性對照,結果(表6)均為陰性,表明該ELISA 方法具有高度的特異性。

表6 間接ELISA 方法的特異性試驗

2.2.7 臨床血清樣品檢測結果 用建立的間接ELISA 方法對臨床80 份血清樣品進行檢測,同時和購買的商品化試劑盒進行比較。結果顯示,本研究建立的ELISA 方法檢出陽性樣品48 份,商品化試劑盒檢出陽性樣品45 份,兩種方法陽性符合率為93%。

3 討論

目前,基于PCV2 分離株的序列比較可知其大致分為5 個基因型：PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e[6],已報道與豬群中許多疾病的發(fā)生有顯著關系,并與PMWS 有直接關聯(lián)[7]。PCV2 感染后會引起機體的細胞凋亡,病毒通過刺激細胞凋亡可躲避宿主免疫系統(tǒng)或誘導宿主感染細胞死亡,從而加快病毒粒子向周圍細胞的擴散,促進病毒的增殖[8]。PCV2 ORF3 為非結構性蛋白,牽涉誘導受感染細胞的凋亡,被認為與PCV2 的發(fā)病機制和全身性擴散密切相關。華麗等[9]利用生物信息學軟件發(fā)現(xiàn)ORF3 成熟蛋白有4 個主要的抗原位點。Stevenson[10]等證明ORF3(31aa～50aa)編碼的多肽可以誘導T 淋巴細胞的增殖能力。研究還發(fā)現(xiàn),PCV2 ORF3蛋白可以引起免疫小鼠血清中IL-4 濃度顯著升高,表明ORF3 蛋白在PCV2 誘發(fā)的體液免疫中發(fā)揮一定的作用[11]。PCV2 抗體檢測的方法有多種,其中ELISA 檢測與常用的免疫過氧化物酶單層細胞試驗、免疫組織化學技術和間接免疫熒光試驗相比,其操作更加簡便、敏感性好,能夠快速檢測大量樣品[12]。

本研究構建ORF3 重組蛋白,并使用重組蛋白作為包被抗原建立抗體檢測的間接ELISA 方法。經(jīng)驗證,所建立的ELISA 方法的特異性以及與商品化試劑盒檢測結果的陽性符合率均較高。綜合李鵬飛[13]使用ORF2 蛋白作為包被抗原所建立的檢測豬圓環(huán)病毒抗體的間接ELISA 方法,本研究用的重組蛋白包含了PCV2 特異性的抗原位點,能夠區(qū)分PCV1 和PCV2;兩種抗體檢測試劑盒均能將PCV2 與CSFV、PRRSV、PRV 進行區(qū)分,在實際應用中具有較大意義。

綜上,本試驗為進一步研究PCV2 ORF3 蛋白提供了思路,建立的間接ELISA 方法可以用于檢測單克隆抗體效價、疫苗免疫動物后免疫效果的監(jiān)測,為其他研究人員檢測PCV2 抗體提供了方法。進一步研究會將得到的重組蛋白用于兔子和小鼠的免疫,并利用建立的檢測方法對免疫后抗體效價進行測定,為PCV2 疫苗的研發(fā)、疾病的防控提供基礎。