王宏洪 蔡潤得 黃少彬

摘要 在對廣東省主要珍貴樹種上的線蟲進行調(diào)查時從格木Erythrophleum fordii上分離到一種隱皮孢囊線蟲，經(jīng)形態(tài)特征觀察和測量數(shù)據(jù)分析，將其鑒定為卡勒薩隱皮孢囊線蟲Cryphodera kalesari。其診斷特征為：雌蟲橢圓形至近球形，頭部具有1個唇盤和2～3個唇環(huán)，口針長33.6～37.8 μm，陰門唇突出，陰門與肛門之間區(qū)域凹陷，肛陰距為42～72 μm;2齡幼蟲頭部具1個明顯的唇盤和3個唇后環(huán)紋，口針長24.8～29.5 μm，口針基部球前緣凹陷，側(cè)區(qū)3條側(cè)線，尾長圓錐形，長38～53.5 μm，尾末端細(xì)圓，透明尾長17.1～25.1 μm，側(cè)尾腺孔位于肛門后2～5環(huán);雄蟲未發(fā)現(xiàn)。本研究首次獲得了卡勒薩隱皮孢囊線蟲的rDNA（LSU D2D3和ITS）序列，為此線蟲的鑒定提供了可靠的分子數(shù)據(jù)。本研究還分析了卡勒薩隱皮孢囊線蟲與本屬其他種類的系統(tǒng)進化關(guān)系?？ɡ账_隱皮孢囊線蟲為中國的地理新記錄種。格木為隱皮孢囊線蟲的新寄主。

關(guān)鍵詞 格木; 卡勒薩隱皮孢囊線蟲; 形態(tài)學(xué); 分子數(shù)據(jù); 中國新記錄

中圖分類號： S 432.45 ?文獻標(biāo)識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019137

Abstract A species of cystoid nematode parasitizing Erythrophleum fordii was isolated during the survey of plant nematodes associated with precious trees in Guangdong province. Detailed morphological study confirmed the cystoid nematode as Cryphodera kalesari. The nematode was characterized by oval to near round females with 2-3 lip annuli and one distinct labial disc， a stylet of 33.6-37.8 μm in length， a protruding vulval lip， concave vulva-anus profile， a vulva-anus distance of 42-72 μm. Second-stage juveniles possessed 3 lip annuli and one labial disc， a stylet of 24.8-29.5 μm in length with concave knobs and 3 lines at the lateral field， an elongate-conoid tail， 38-53.5 μm long， with a narrow rounded tip， hyaline tail region of 17.1-25.1 μm long， phasmids with a lens-like structure located 2-5 annuli posterior to the anus. Male was absent. LSU rDNA D2D3 segment and rDNA-ITS fragment were amplified and sequenced， which provided molecular information for rapid and accurate detection of the cystoid nematode in the future. Moreover， the phylogenetic relationship of C.kalesari and other Cryphodera species was analyzed. C.kalesari was reported for the first time from China. Erythrophleum fordii is a new reported host plant of C.kalesari.

Key words Erythrophleum fordii; Cryphodera kalesari; morphology; molecular data; first record in China

格木Erythrophleum fordii Oliv.，別名鐵木、斗登風(fēng)，豆科格木屬常綠喬木，生于山地密林或疏林中。廣東、廣西、浙江、福建、臺灣等地為其天然分布區(qū)[1]。格木為國產(chǎn)著名硬木之一[1]，被列為國家II級重點保護野生植物[2]。

隱皮孢囊屬Cryphodera線蟲是一類不形成孢囊（non-cyst-forming or cystoid）的異皮科Heteroderidae線蟲[3]。全世界已報道7個已知種和6個未定種[4-6]。中國曾從泰國輸華的柏木中截獲布林克曼隱皮孢囊線蟲 C.brinkmani Karssen & Van Aelst， 1999[7-8]。而國內(nèi)僅報道過一種寄生苧麻的隱皮孢囊線蟲——中華隱皮孢囊線蟲C.sinensis Zhuo， Wang， Ye， Peng & Liao， 2014[5]。

作者在對廣東省主要珍貴樹種植物線蟲進行調(diào)查時從格木根系上及根圍土壤中采集分離到一種隱皮孢囊線蟲。通過形態(tài)特征觀察、測量和拍照，以及詳細(xì)的形態(tài)描述，將其鑒定到種的水平。此外，我們還對該線蟲的LSU rDNA D2D3區(qū)和rDNA-ITS序列進行了擴增和測序，并分析了隱皮孢囊線蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

用內(nèi)徑10 cm的不銹鋼土壤取樣管（宏光儀器）采集廣東省廣州市從化區(qū)流溪河國家森林公園格木根圍土壤和根系，取樣深度約為20 cm，每個樣品約500 g，裝入自封袋，編號CH06，記錄采樣時間、采樣地點和寄主等信息。

1.2 線蟲分離、標(biāo)本制作、形態(tài)測量和拍照

用60目不銹鋼篩網(wǎng)（上虞儀器）篩出土壤中細(xì)根。在體視鏡下用鑷子檢查細(xì)根和植物根系，從根上剝離白色雌蟲（圖1）。用貝曼漏斗法分離土壤中的線蟲，時間為24 h。在體視顯微鏡下，將土壤中分離到的隱皮孢囊線蟲2齡幼蟲挑入清水中，加入等體積煮沸的8%甲醛溶液，蟲體熱殺死后至少固定24 h;用甘油酒精法對幼蟲進行脫水，然后將幼蟲挑入純甘油，石蠟封片[9]。利用科研級尼康顯微鏡（ECLIPSE 90i，Nikon，日本）進行線蟲形態(tài)測量和拍照[10]。

1.3 DNA抽提、擴增和測序

用蛋白酶K法抽提單條幼蟲DNA，具體步驟參照Mundo-Ocampo等[11]。LSU rDNA D2D3區(qū)的擴增引物為D2A（5′-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT-3′）和D3B（5′-TCG GAA GGA ACC AGC TAC TA-3′）[12]，rDNA-ITS區(qū)擴增引物為18S（5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′）和26S（5′-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3′）[13]。PCR反應(yīng)體系參照DNA聚合酶說明書（Ex Taq，TaKaRa，日本）。PCR擴增程序、電泳檢測和測序參照王宏洪等[10]。用DNAstar Lasergene 7.0軟件的SeqMan程序?qū)y序結(jié)果進行拼接和編輯，將最終序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫，獲取序列登錄號。

1.4 系統(tǒng)進化分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫分別下載隱皮孢囊線蟲屬有關(guān)種的28S rDNA D2D3和rDNA-ITS序列。序列比對、核酸替代模型選擇、系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建、系統(tǒng)進化樹的打開和編輯參考王宏洪等[10]。外組的選擇參照Subbotin等[6]?；趓DNA 28S D2-D3序列構(gòu)建的隱皮孢囊線蟲系統(tǒng)進化樹，外群為Scutellonema brachyurum （Steiner，1938） Andrassy， 1958 （JX472046）;基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，外群為Hoplolaimus columbus Sher， 1963（DQ309584）。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)鑒定結(jié)果

形態(tài)測計值見表1和表2，表中符號采用De Man公式。

雌蟲形態(tài)特征：蟲體橢圓形至近球形，環(huán)紋清晰，頸部向背部或腹部彎曲（圖1d～e;圖2A）。頭部具一個明顯唇盤和2～3個唇環(huán)（圖2G～I）。口針長33.6～37.8 μm（圖2G～H）。中食道球卵圓形，長16.3～26.3 μm，寬12.5～24.9 μm（圖2B）。基部食道腺緊鄰中食道球，小且不清晰（圖2B）。排泄孔位于頸部之后（圖2B）。陰門裂長39.4～59 μm（圖2E～F）。陰門唇突出（圖2A、2D）。肛陰距為42～72 μm（圖2C～F）。陰門與肛門之間區(qū)域略凹陷或明顯凹陷（圖2C～D），具明顯線紋（圖2E～F）。

2齡幼蟲形態(tài)特征：熱殺死后，蟲體直或略向腹面彎區(qū)（圖3a）。側(cè)區(qū)不明顯，3條側(cè)線（圖3e）。頭部具一個明顯的唇盤和3個唇后環(huán)紋（圖3c～d）?？卺橀L24.8～29.5 μm，口針基部球前緣略凹陷至明顯凹陷（圖3c～d）。背食道腺開口至口針基部球距離3～4.5 μm（圖3c～d）。食道腺充滿整個體腔，長34.4～60.5 μm（圖3a～b）。排泄孔至體前端距離82.4～101.5 μm（圖3b）。半月體緊鄰排泄孔之后（圖3f）。生殖原基小，卵圓形，至尾末端距離占體長的58%～67%（圖3g）。尾長圓錐形，長38～53.5 μm，尾末端細(xì)圓（圖3h～i）。側(cè)尾腺孔棱鏡狀，位于肛門后2～5環(huán)（圖3j）。透明尾長17.1～25.1 μm（圖3h～i）。

雄蟲：未發(fā)現(xiàn)。

寄主：格木Erythrophleum fordii Oliv.。

經(jīng)形態(tài)特征和測計值比對，采自廣東從化格木上的隱皮孢囊線蟲群體為卡勒薩隱皮孢囊線蟲C.kalesari Bajaj， Walia， Dabur & Bhatti， 1989。與原始描述[14]相比，卡勒薩隱皮孢囊線蟲中國群體雌蟲體長偏大（336.8～481.4 μm vs 272～353 μm），口針略短（33.6～37.8 μm vs 37～42 μm），陰門裂更長（39.4～59 μm vs 35 μm），其余形態(tài)特征基本一致?？ɡ账_隱皮孢囊線蟲中國群體與原始描述的差異可能與地理環(huán)境有關(guān)。因此，該群體鑒定為卡勒薩隱皮孢囊線蟲。

卡勒薩隱皮孢囊線蟲與中華隱皮孢囊線蟲形態(tài)最接近。與中華隱皮孢囊線蟲相比，卡勒薩隱皮孢囊線蟲雌蟲口針更長（33.6～37.8 μm vs 28～35.4 μm），肛陰距更長（42～72 μm vs 29.5～35.8 μm），2齡幼蟲口針更短（24.8～29.5 μm vs 28～31 μm），尾末端有尖突（vs 細(xì)圓），尾和透明尾更短（38～53.5 μm vs 52～65 μm;17.1～25.1 μm vs 24.5～35 μm）。此外，卡勒薩隱皮孢囊線蟲缺乏雄蟲。

2.2 分子序列分析

經(jīng)擴增和測序，獲得卡勒薩隱皮孢囊線蟲中國群體LSU rDNA D2D3區(qū)片段長度為699 bp，GenBank的登錄號為MK541650。BLAST結(jié)果顯示，此群體與Cryphodera sp. B（MF425671）的序列相似性最高，為93.7%;與布林克曼隱皮孢囊線蟲（KY512575）和中華隱皮孢囊線蟲（JX566455）的序列相似性次之，為92.3%。

擴增得到的卡勒薩隱皮孢囊線蟲中國群體rDNA-ITS片段長度為1 122 bp，GenBank的登錄號為MK541651。BLAST結(jié)果顯示，此群體與中華隱皮孢囊線蟲（JX566457-JX566459）的序列相似性最高，為76.6%～76.8%。

2.3 系統(tǒng)進化分析

rDNA 28S D2-D3區(qū)序列比對數(shù)據(jù)集包含38條序列，比對后的長度為684 bp，其中保守位點422個，簡約信息位點185個。圖4為基于rDNA 28S D2 D3 序列在GTR+I+G模型下的貝葉斯一致樹，卡勒薩隱皮孢囊線蟲與Cryphodera sp. B、中華隱皮孢囊線蟲、布林克曼隱皮孢囊線蟲和Cryphodera sp. 聚為一個高度支持的分支（PP=96），并處于分支的基部。rDNA-ITS區(qū)序列比對數(shù)據(jù)集包含41條序列，比對后的長度為1 183 bp，其中保守位點266個，簡約信息位點846個。圖5為基于rDNA-ITS序列在TVM+I+G模型下的貝葉斯一致樹，卡勒薩隱皮孢囊線蟲與Cryphodera sp. B、Cryphodera sp.和布林克曼隱皮孢囊線蟲聚為一個中度支持的分支（PP=86），卡勒薩隱皮孢囊線蟲與其他隱皮孢囊線蟲種類的系統(tǒng)進化關(guān)系不清楚。

3 結(jié)論與討論

本研究將采自廣東省廣州市從化區(qū)良口鎮(zhèn)流溪河國家森林公園格木的隱皮孢囊線蟲鑒定為卡勒薩隱皮孢囊線蟲，該線蟲為中國新記錄種。本文首次獲得了卡勒薩隱皮孢囊線蟲的28S rDNA D2D3區(qū)和rDNA-ITS序列，為今后隱皮孢囊線蟲的種類鑒定提供了分子依據(jù)。

Bajaj等1989年最早在印度哈里亞納邦卡勒薩森林的羽萼木Colebrookea oppositifolia Smith根上發(fā)現(xiàn)卡勒薩隱皮孢囊線蟲[14]。此線蟲廣泛分布于位于印度哈里亞納邦和喜馬偕爾邦的西瓦里克山脈的天然林中[16]，分布區(qū)的氣候類型為熱帶季風(fēng)氣候，主要特點是全年暖熱，降水明顯分旱、雨兩季[17]。本次報道的卡勒薩隱皮孢囊線蟲分布區(qū)的氣候類型是熱帶季風(fēng)氣候，氣候溫和，雨量充沛[18]。

本文明確了格木為卡勒薩隱皮孢囊線蟲的新寄主。受侵染的格木根系表面無明顯癥狀，雌蟲嵌入根系，突出的尾部通常黏附土壤顆粒，不容易沖洗干凈。格木是我國重要的珍貴樹種，線蟲病害是格木苗期的主要病害，但線蟲種類未知[19]。本研究首次報道了侵染格木根系的一種隱皮孢囊線蟲，其對格木生長的危害程度仍需進一步研究。

目前，已報道的7個隱皮孢囊屬有效種中有3個發(fā)現(xiàn)于亞洲，分別是卡勒薩隱皮孢囊線蟲C.kalesari（印度和中國），布林克曼隱皮孢囊線蟲C.brinkmani（日本和泰國）和中華隱皮孢囊線蟲C.sinensis（中國和越南）[6]。Nguyen等從越南采集了大量隱皮孢囊線蟲種群，通過比對分析2齡幼蟲的形態(tài)測量數(shù)據(jù)和rDNA-ITS序列數(shù)據(jù)，認(rèn)為其中至少存在5個種類[20]。Subbotin等重新分析了來自越南的樣品，推測其中有7個種類，除了分布最廣泛的中華隱皮孢囊線蟲，另外還有6個潛在新種[6]。近年來，我們在華南地區(qū)各省份也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些隱皮孢囊線蟲種群，由于僅發(fā)現(xiàn)2齡幼蟲，缺乏雌蟲形態(tài)數(shù)據(jù)，未能鑒定到種。因此，中國南部和越南可能是隱皮孢囊線蟲的起源和多樣性中心，說明隱皮孢囊線蟲在這個區(qū)域正在進行相對快速率的物種形成[6]。

參考文獻

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第39卷），豆科（一）[M].北京：科學(xué)出版社，1988：117.

[2] 于永福.中國野生植物保護工作的里程碑——《國家重點保護野生植物名錄（第一批）》出臺[J].植物雜志，1999，5（3）：3-11.

[3] SIDDIQI M R.Tylenchida，parasites of plants and insects [M].London：CABI，2000.

[4] VOVLAS N，TRISCIUZZI N，TROCCOLI A，et al.Integrative diagnosis and parasitic habits of Cryphodera brinkmani a non-cyst forming heteroderid nematode intercepted on Japanese white pine bonsai trees imported into Italy [J].European Journal of Plant Pathology，2013，135（4）：717-726.

[5] ZHUO Kan，WANG Honghong，YE Weimin，et al.Cryphodera sinensis n.sp.（Nematoda：Heteroderidae），a non-cyst-forming parasitic nematode from the root of ramie Boehmeria nivea in China [J].Journal of Helminthology，2014，88（4）：468-480.

[6] SUBBOTIN S A，AKANWARI J，NGUYEN C N，et al.Molecular characterisation and phylogenetic relationships of cystoid nematodes of the family Heteroderidae （Nematoda：Tylenchida） [J].Nematology，2017，19（9）：1065-1081.

[7] 龍海，齊小峰，謝泳桂，等.泰國輸華真柏中一種隱皮孢囊線蟲的鑒定[J].植物檢疫，2017，31（3）：29-32.

[8] KARSSEN G，AELST A.Description of Cryphodera brinkmani n.sp.（Nematoda：Heteroderidae），a parasite of Pinus thunbergii Parlatore from Japan，including a key to the species of the genus Cryphodera Colbran，1966 [J]. Nematology， 1999， 1（2）：121-130.

[9] 馮志新.植物線蟲學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[10] WANG Honghong，ZHUO Kan，YE Weimin，et al.Morphological and molecular characterisation of Pratylenchus parazeae n.sp.（Nematoda：Pratylenchidae） parasitizing sugarcane in China[J].European Journal of Plant Pathology，2015，143（1）：173-191.

[11] MUNDO-OCAMPO M，TROCCOLI A，SUBBOTIN S A，et al.Synonymy of Afenestrata with Heterodera supported by phylogenetics with molecular and morphological characterisation of H.koreana comb.n.and H.orientalis comb.n.（Tylenchida：Heteroderidae） [J].Nematology，2008，10（5）：611-632.

[12] SUBBOTIN S A，STURHAN D，CHIZHOV V N，et al.Phylogenetic analysis of Tylenchida Thorne，1949 as inferred from D2 and D3 expansion fragments of the 28S rRNA gene sequences [J].Nematology，2006，8（3）：455-474.

[13] VRAIN T C，WAKARCHUK D A，LEVESQUE A C，et al.Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group [J].Fundamental and Applied Nematology，1992，15（6）：563-573.

[14] BAJAJ H K，WALIA R K，DABUR K R，et al.Cryphodera kalesari，a new heteroderid nematode species from Haryana，India [J].Systematic Parasitology，1989，14（2）：113-116.

[15] ANDRSSY I.Hoplolaimus tylenchiformis Daday，1905 （syn.H.coronatus Cobb，1923） und die gattungen der unterfamilie Hoplolaiminae Filipjev，1936 [J]. Nematologica，1958（3）：44-56.

[16] BAJAJ H K，WALIA R K.Host response to Cryphodera kalesari （Heteroderidae：Nematoda）[J].Nematologia Mediterranea，2000，28（2）：197-199.

[17] 張兆明.淺析熱帶季風(fēng)氣候的差異性[J].地理教育，2010（10）：26-27.

[18] 吳章文.流溪河國家森林公園旅游氣候研究[J].中南林學(xué)院學(xué)報，1995（10）：67-74.

[19] 李勝強，許建新，陳波，等.珍稀植物格木的研究進展[J].廣東林業(yè)科技，2008，24（6）：61-64.

[20] NGUYEN C N，STURHAN D，SUBBOTIN S A.Studies on the occurrence and diversity of Heteroderidae and Meloidogynidae （Nematoda：Tylenchida） in natural forests of Vietnam [J].Russian Journal of Nematology，2011，19（2）：159-172.

（責(zé)任編輯： 田 喆）