,3,3,3，*

(1.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(北京),北京 100083;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心,北京 100045;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是茄科多年生草本植物,在世界范圍內(nèi)廣泛種植[1]。由于其耐干旱,穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn),抗災(zāi)力強(qiáng),成為世界上僅次于小麥、水稻、玉米的第四大糧食作物[2],距今已有7000多年的栽培歷史[3]。由于馬鈴薯營養(yǎng)均衡、產(chǎn)業(yè)鏈長等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于主食消費(fèi)和加工利用,是歐美、非洲等70多個(gè)國家的主食作物[4]。

茄堿是存在于馬鈴薯中的天然的甾體糖苷類生物堿毒素,又名龍葵堿、龍葵素,主要由葡萄糖殘基和茄啶組成的一種弱堿性糖苷[5]。馬鈴薯中的茄堿主要是α-茄堿(α-solanine)和α-卡茄堿(α-chaconine)[6],其含量占糖苷類生物堿總量的90%以上[7]。在馬鈴薯的芽、未成熟塊莖、成熟薯皮及靠近薯皮的組織中含量較高[8]。茄堿通過抑制膽堿酯酶活性而對胃腸道黏膜有較強(qiáng)的刺激性和腐蝕性[9]、對中樞神經(jīng)有麻痹作用、對紅細(xì)胞有溶血作用[10],可引起急性腦水腫、胃腸炎等。中毒的主要表現(xiàn)為胃痛加劇,惡心嘔吐,呼吸困難,伴隨全身虛弱和衰竭[11],也可以致畸[12],導(dǎo)致腦畸形和脊柱裂[13],嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡[14]。由此可見,茄堿中毒是不容忽視的食品安全問題[15]。

目前茄堿提取方法主要有勻漿提取法[16]、超聲提取法[17]、微波輔助提取法[18]、攪拌浸提法[19]、回流提取法等[20],檢測方法多采用高效液相色譜[21-24],液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[25-28]。傳統(tǒng)的提取方法多采用酸提堿沉的方法,時(shí)間長、步驟復(fù)雜,回收率偏低,而用液相色譜方法時(shí),檢測波長在紫外區(qū),易受到雜質(zhì)干擾,難以用于較復(fù)雜樣品的檢測。此外,馬鈴薯中茄堿的檢測方法較為陳舊,我國現(xiàn)有的茄堿檢測方法不完善,因此,如何改進(jìn)馬鈴薯中茄堿的提取條件、提高回收率,建立新的檢測技術(shù),已成為該研究領(lǐng)域急待解決的問題[29]。

本文通過乙酸水溶液對馬鈴薯及馬鈴薯粉中的α-茄堿和α-卡茄堿進(jìn)行提取,馬鈴薯樣品提取后直接過膜上機(jī),馬鈴薯粉采用C18 SPE柱凈化后即可過膜上機(jī),操作簡便、高效、快速,避免了超聲、振蕩、回流和離心等耗時(shí)長的前處理方式;采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測,重復(fù)性好、精密度好、檢測效率高,不但可以避免了雜質(zhì)干擾的影響,還可以完成α-茄堿和α-卡茄堿的同時(shí)檢測,為低含量茄堿的檢測提供了準(zhǔn)確可靠的實(shí)用方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯及馬鈴薯粉 購自超市,馬鈴薯編號為S1～S12,馬鈴薯粉編號為S13～S15。甲醇、乙腈、無水乙醇、甲酸和冰乙酸 色譜純;甲酸銨 分析純;α-茄堿(20562-02-1,純度≥99%)和α-卡茄堿(20562-03-2,純度≥99%) 北京百靈威科技有限公司;Milli Q超純水。

Agilent 1260/6460高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司;T25高速勻漿機(jī) 北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;C18固相萃取柱柱(500 mg/3 mL) 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 采用直接進(jìn)樣的方式,分別在正離子和負(fù)離子模式下對α-茄堿和α-卡茄堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描,優(yōu)化質(zhì)譜條件。

1.2.2 色譜條件優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)比較了0.1%甲酸-乙腈,2 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈、5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈,10 mmol/L甲酸銨(0.1%甲酸)等流動相體系對其分離效果的影響。

1.2.3 馬鈴薯中茄堿的提取方法 馬鈴薯去掉表面泥土,切塊后制成勻漿,稱取5.0 g勻漿后的樣品于200 mL燒杯中,加入不同比例的提取溶劑,采用不同的方法進(jìn)行提取,提取液定容至100 mL,上機(jī)前取2 mL提取液用流動相定容至10 mL,過0.22 μm微孔濾膜后分析。

1.2.3.1 提取溶劑優(yōu)化 分別用乙酸-水-NaHSO3(5/100/0.5,v/v/w)、5%乙酸水溶液、10%乙酸水溶液、15%乙酸水溶液、1%乙酸乙醇溶液、5%乙酸乙醇溶液和10%乙酸乙醇溶液等7種溶液作為提取劑對馬鈴薯中茄堿進(jìn)行提取,比較不同提取溶劑的提取效果。

1.2.3.2 提取方式的優(yōu)化 分別采用勻漿提取[16]、超聲提取[17]、回流提取[20]及振蕩提取[27]方式對馬鈴薯中的茄堿進(jìn)行提取,比較不同提取方式的提取效果。

1.2.3.3 料液比的優(yōu)化 采用勻漿提取方式,以1∶2、1∶3、1∶5、1∶10等不同料液比對馬鈴薯中茄堿提取效果的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間的優(yōu)化 以10%的乙酸水溶液為提取液,料液比為1∶10,采用勻漿提取方式,比較提取為1、2、3、4 min的提取效果。

1.2.4 馬鈴薯粉中茄堿的提取方法 稱取1.0 g馬鈴薯粉于200 mL燒杯中,加10 mL的10%乙酸水浸泡30 min,再加40 mL的10%乙酸水,勻漿提取3 min,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用10%乙酸水定容。

1.2.5 凈化條件的優(yōu)化 取馬鈴薯粉提取液30 mL于離心管中,10000 r/min離心5 min。取上清液5 mL加到預(yù)先用5 mL甲醇,5 mL 10%乙酸水溶液活化的固相萃取柱中,5 mL 15%甲醇水溶液淋洗,分別用不同洗脫液進(jìn)行洗脫。取1 mL洗脫液用流動相稀釋10倍后,過0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)行分析。

1.2.6 色譜條件

1.2.6.1 液相色譜條件 色譜柱:Agilent C18柱(100 mm×3.0 mm,2.7 μm);流動相A為5 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸),流動相B為乙腈;梯度洗脫條件:78%的A保持2 min,5 min后變?yōu)?5%的A保持2 min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量3 μL;流速0.30 mL/min。

1.2.6.2 質(zhì)譜條件 毛細(xì)管電壓:3.5 kv;噴嘴電壓:500 V;干燥氣體溫度:350 ℃;干燥氣流量:10 L/min;鞘氣溫度:300 ℃;鞘氣流速:11 L/min。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別稱取α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,加甲醇溶解并定容至10.0 mL,配成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。吸取α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇逐級稀釋,配制成濃度分別為0.010、0.025、0.050、0.10、0.25、0.50和1.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.8 樣品中茄堿含量計(jì)算

其中,X為試樣中待測組分含量,單位為毫克每千克(mg/kg);ρ為標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣中α-茄堿或α-卡茄堿的質(zhì)量濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);V為試樣定容體積,單位為毫升(mL);m為試樣的質(zhì)量,單位為克(g);f為稀釋倍數(shù);1000為單位換算系數(shù)。

1.2.9 方法的準(zhǔn)確度和精密度 分別按1.2.3和1.2.4稱取一定量的馬鈴薯及馬鈴薯粉樣品于燒杯中,添加一定濃度的α-茄堿和α-卡茄堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液,使馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿添加水平分別為5.00、20.0和50.0 mg/kg;馬鈴薯粉中α-茄堿和α-卡茄堿的添加水平分別為50.0、100和200 mg/kg,放置30 min后,按所建立的方法進(jìn)行提取測定,計(jì)算樣品的添加回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在正離子和負(fù)離子模式下對α-茄堿和α-卡茄堿進(jìn)行母離子掃描,設(shè)置掃描范圍為300～900 amu,結(jié)果表明,兩種茄堿在正離子模式下響應(yīng)較高。確定掃描方式、母離子后,優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能量,優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表1。

表1 α-茄堿和α-卡茄堿多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Table 1 Parameters of MRM for α-solanine and α-chaconine

注:*為定量離子。

2.2 流動相的優(yōu)化

α-茄堿和α-卡茄堿結(jié)構(gòu)類似,在色譜中的保留時(shí)間相近,為了達(dá)到較好的分離效果,提高離子化效率,實(shí)驗(yàn)對流動相組成及洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,流動相中加入甲酸銨后α-茄堿和α-卡茄堿分離度增加。隨著甲酸銨濃度的增加,α-茄堿的響應(yīng)值有所提高而α-卡茄堿的響應(yīng)值有所下降。綜合考慮響應(yīng)值和分離度的影響,實(shí)驗(yàn)選擇5 mmol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)-乙腈作為流動相。α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子及提取離子色譜圖見圖1。

圖1 α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子及提取離子色譜圖 Fig.1 MRM chromatograms of α-solanineand α-chaconine standard solution

2.3 提取方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化 提取溶劑優(yōu)化結(jié)果見圖2。溶劑的選擇參考國內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)[16-27],主要是由乙酸、乙醇、水組成的體系[16-17,27],其中乙酸-水-NaHSO3(5/100/0.5,v/v/w)為美國分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)方法中[16]的提取溶液。

圖2 提取溶劑對馬鈴薯中茄堿提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction solventon solanine extraction in potato

從圖2中可以看出,隨著乙酸濃度的提升,茄堿的含量也在逐步增加,這與茄堿具有弱酸性,在酸性條件下能成鹽,增加其溶解度有關(guān)。以乙酸水溶液為提取溶劑要優(yōu)于乙酸乙醇;未加亞硫酸氫鈉的乙酸水溶液的提取效果更好。在酸水體系中,雖然15%乙酸水提取的茄堿含量略高,但是差異并不顯著,實(shí)驗(yàn)最終選用10%的乙酸水溶液作為提取溶劑。

2.3.2 提取方式的優(yōu)化 提取方式對馬鈴薯中茄堿提取效果的影響見表2。

表2 提取方式對馬鈴薯中茄堿提取效果的影響Table 2 Effect of extraction methodon solanine extraction in potato(n=3)

從表2中可以看出,勻漿提取的效果明顯高于其他的提取方式,勻漿提取3 min的提取效果大于加熱回流5 h,也高于振蕩提取2 h的效果;超聲提取40 min效果優(yōu)于60 min,這可能是超聲時(shí)間過長時(shí),超聲波的機(jī)械、空化效應(yīng)可能破壞生物堿的結(jié)構(gòu)[15]。實(shí)驗(yàn)最終選擇勻漿3 min的提取方式。

2.3.3 料液比的優(yōu)化 料液比的優(yōu)化結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出,隨著料液比的增加,樣品含量略有增加,當(dāng)料液比提高至1∶10時(shí),提取效果與料液比為1∶5時(shí)無明顯差異,考慮到不同品種馬鈴薯中茄堿含量的差異及勻漿時(shí)提取液的體積,試驗(yàn)最終選擇提取料液比1∶10。

圖3 料液比對馬鈴薯中茄堿提取效果的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratioon solanine extraction in potato

2.3.4 提取時(shí)間的優(yōu)化 不同提取時(shí)間對馬鈴薯中茄堿提取效果見圖4。從圖中可以看出,隨著提取時(shí)間的增加,α-茄堿和α-卡茄堿的含量略有增加,提取3和4 min的提取效果比較無明顯差異。考慮提取時(shí)間和提取效果等因素,實(shí)驗(yàn)最終確定提取時(shí)間為3 min。

圖4 提取時(shí)間對馬鈴薯中茄堿提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction timeon solanine extraction in potato

2.3.5 凈化條件的優(yōu)化 馬鈴薯粉為加工產(chǎn)品,在生產(chǎn)過程中可能添加糖、鹽及其他化合物,為了減少基質(zhì)干擾,采用C18固相萃取柱對樣品提取液進(jìn)行凈化,實(shí)驗(yàn)比較了不同洗脫液對洗脫效率的影響,結(jié)果見表3。

表3 洗脫液對茄堿提取效果的影響Table 3 Effect of eluent solution on solanine extraction

含磷酸鹽的洗脫液為AOAC方法中使用的,回收率較好,但該方法凈化后用高效液相色譜法檢測。為減少磷酸鹽對液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)的影響,實(shí)驗(yàn)將磷酸鹽緩沖液替換為水,但回收率明顯下降。將洗脫溶劑換成乙醇水體系時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著洗脫中乙醇含量的增加,柱回收有所增加,而當(dāng)乙醇的含量為100%時(shí),洗脫能力反而下降。實(shí)驗(yàn)最終選擇了含90%乙醇水溶液(含1%甲酸)作為洗脫液。

2.3.6 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià) 按1.2.7的濃度水平分別用溶劑和馬鈴薯及馬鈴薯粉的基質(zhì)配制α-茄堿和α-卡茄堿的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)行色譜-質(zhì)譜分析,計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)(%)=(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100來計(jì)算。

結(jié)果表明,馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿的基質(zhì)效應(yīng)分別為4.73%和3.85%;馬鈴薯粉中α-茄堿和α-卡茄堿的基質(zhì)效應(yīng)分別為2.04%和2.15%,均小于±20%,基質(zhì)效應(yīng)較弱,因此可以用溶劑標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品的定量分析。

2.4 線性范圍和定量限

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜中,以濃度為橫坐標(biāo),定量離子峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,α-茄堿和α-卡茄堿在0.01～1.00 μg/mL范圍內(nèi)線性良好,α-茄堿線性方程為y=8393843x-93195,相關(guān)系數(shù)r=0.9998;α-卡茄堿線性方程為y=17650992 x-199331,相關(guān)系數(shù)r=0.9997。以10倍信噪比計(jì)算,馬鈴薯α-茄堿的定量限為0.80 μg/kg,α-卡茄堿的定量限為0.42 μg/kg;馬鈴薯粉α-茄堿的定量限為25 μg/kg,α-卡茄堿的定量限為14 μg/kg。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

方法的準(zhǔn)確度采用添加回收的方式進(jìn)行評價(jià),馬鈴薯及馬鈴薯粉中α-茄堿和α-卡茄堿的添加回收率和精密度測定結(jié)果見表4。

表4 馬鈴薯及馬鈴薯粉中α-茄堿和α-卡茄堿的添加率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions of α-chaconine and α-solanine in potato and potato powder(n=6)

從表4中可以看出,馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿添加回收率在90.1%～107%之間,RSD在1.7%～5.0%之間;馬鈴薯粉α-茄堿和α-卡茄堿添加回收率在90.0%～110%之間,RSD在1.6%～4.9%之間,滿足樣品測定的要求。

2.6 市售樣品分析

采用本實(shí)驗(yàn)建立的方法,對市售12個(gè)馬鈴薯樣品和3個(gè)馬鈴薯粉進(jìn)行了檢測,結(jié)果見表5。從表中可以看出馬鈴薯中α-茄堿的含量在8.11～40.8 mg/kg之間,α-卡茄堿的含量在14.2～52.6 mg/kg之間。馬鈴薯粉中α-茄堿的含量在91.7～140 mg/kg之間,α-卡茄堿的含量在95.9～400 mg/kg之間?？傮w看α-卡茄堿的含量高于α-茄堿的含量。

表5 市售樣品中茄堿的檢測結(jié)果Table 5 Determination of Solaninein commercial samples(n=3)

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定馬鈴薯及馬鈴薯粉中α-茄堿與α-卡茄堿含量的方法。方法采用勻漿提取方式,提取時(shí)間僅需3 min;在低、中、高三個(gè)添加水平的RSD均小于5%;馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿的定量限分別為0.80和0.42 μg/kg,馬鈴薯粉中α-茄堿和α-卡茄堿的定量限分別為25和14 μg/kg。方法簡單快速,重復(fù)性好,靈敏度高,可操作性強(qiáng),適用于馬鈴薯及馬鈴薯粉中的α-茄堿和α-卡茄堿的同時(shí)檢測。對市售12種馬鈴薯樣品和3種馬鈴薯粉進(jìn)行檢測,馬鈴薯中α-茄堿的含量在8.11～40.8 mg/kg之間,α-卡茄堿的含量在14.2～52.6 mg/kg之間;馬鈴薯粉中α-茄堿的含量在91.7～140 mg/kg之間,α-卡茄堿的含量在95.9～400 mg/kg之間。