高 潔,董文賓2,3,王 勇4,*,張泉榮,張文秀

(1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院,陜西西安 710000;2.陜西科技大學(xué),陜西西安 710000;3.陜西省食品加工工程技術(shù)研究中心,陜西西安 710000;4.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院,陜西西安 710000)

皂莢(GleditsiasinensisLam.)系豆科蘇木亞科(或云實(shí)亞科)的多年生木本植物[1],我國(guó)河北、河南、陜西種植面積較廣[2-3]。皂莢不僅具有抗菌、殺蟲(chóng)、殺鼠、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等活性[4-5],同時(shí)還具有免疫調(diào)節(jié)、抗凝血、抗炎等活性[6]。

皂莢的主要化學(xué)成分包含萜類化合物、黃酮類化合物、酚酸類化合物、甾體類化合物和多糖[7]。植物多糖具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、降血糖等生物學(xué)活性[8-9],研究前景較大。多糖提取方法種類較多,不同的提取方法對(duì)多糖活性影響較大,超聲波提取法速度快,時(shí)間少、效果明顯[10],且不受高溫的影響。

當(dāng)前,對(duì)于皂莢的研究報(bào)道主要集中在皂莢刺活性成分、皂莢素[11],而對(duì)皂莢多糖的提取和生物活性研究較為少見(jiàn),已報(bào)道的皂莢多糖提取工藝也以回流法提取為主[12],皂莢多糖的超聲波法提取和體外抗氧化性的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究將皂莢多糖作為主要研究對(duì)象,優(yōu)化其超聲波法提取工藝參數(shù),并對(duì)該法所提取的皂莢多糖開(kāi)展體外抗氧化活性研究,旨在為皂莢資源能夠更有效的利用在醫(yī)藥保健領(lǐng)域提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皂莢 采摘于陜西省眉縣太白山,經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)雷國(guó)蓮教授鑒定為皂莢Gleditsiajaponic.miq;VC分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基基肼(DPPH) 色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;所有分離及活性測(cè)定用有機(jī)溶劑均為分析純。

粉碎機(jī)FW100 天津市泰斯特儀器有限公司;SJIA-650W超聲處理器 寧波市雙嘉儀器有限公司;YP20002電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司;KDC-40低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;DZF-6020型恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海赫田科學(xué)儀器有限公司;TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 皂莢預(yù)處理 稱取一定量的皂莢,凈制后干燥,粉碎并過(guò)40目篩,置于50 ℃恒溫干燥箱中干燥后,備用。

1.2.2 皂莢多糖提取 稱取皂莢粉末,按比例加入水超聲提取3次,取出料液,進(jìn)行離心(3000 r/min,15 min),收集濾液,濃縮,加3倍無(wú)水乙醇沉淀,脫水干燥,利用sevag法除蛋白,冷凍干燥,得皂莢多糖樣品。

1.2.3 皂莢多糖含量測(cè)定 采用硫酸-苯酚法[13]進(jìn)行皂莢多糖含量測(cè)定,根據(jù)線性回歸方程計(jì)算皂莢多糖得率:

式(1)

式中:R:皂莢多糖含量,%;C:多糖濃度,g/mL;V:多糖溶液體積,mL;M:皂莢干粉質(zhì)量,g。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 超聲提取溫度對(duì)皂莢多糖得率的影響 固定液料比40∶1 (mL/g),超聲提取溫度50 ℃,超聲時(shí)間30 min,超聲功率250 W,考察不同超聲提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對(duì)得率的影響。

1.2.4.2 液固比對(duì)皂莢多糖得率的影響 固定超聲溫度50 ℃,超聲時(shí)間30 min,超聲功率250 W,考察不同液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 (mL/g))對(duì)得率的影響。

1.2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)皂莢多糖得率的影響 固定液固比40∶1 (mL/g),超聲溫度50 ℃,超聲功率250 W,考察不同超聲時(shí)間(10、30、50、70、90 min)對(duì)得率的影響。

1.2.4.4 超聲功率對(duì)皂莢多糖得率的影響 固定液固比40∶1 (mL/g),超聲溫度50 ℃,超聲時(shí)間30 min,考察不同超聲功率(50、150、250、350、450 W)對(duì)得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 以皂莢多糖得率為響應(yīng)值,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定水平范圍,采用四因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì),進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,模型確立,從而確定超聲波提取皂莢多糖的最優(yōu)提取工藝條件。

1.2.6 皂莢多糖體外抗氧化活性試驗(yàn)

式(2)

式中:R:O-2·清除率,%;A0:空白對(duì)照液的吸光度;Ai:加入皂莢多糖溶液的吸光度。

1.2.6.2 DPPH·清除能力的測(cè)定 將等體積皂莢多糖溶液及DPPH·溶液(0.2 mmol/L)混勻后避光靜置反應(yīng)30 min,以無(wú)水乙醇為參照,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Ai。同時(shí),測(cè)得樣品溶液與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度Aj,并測(cè)得DPPH·溶液(0.2 mmol/L)與等體積無(wú)水乙醇混合液的吸光度Ac,以VC為陽(yáng)性對(duì)照[16],則皂莢多糖對(duì)DPPH·的清除率計(jì)算公式如下:

式(3)

式中:R:DPPH·清除率,%;A0:DPPH·與無(wú)水乙醇混合液的吸光度;Ai:DPPH·與樣品反應(yīng)后的吸光度;Aj:不加鄰苯三酚的皂莢多糖與無(wú)水乙醇溶液的吸光度

1.2.6.3 ·OH清除能力的測(cè)定 取10 mmol/L水楊酸鈉-乙醇溶液、10 mmol/L FeSO4溶液、待測(cè)樣品各1 mL,混勻后于37 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min。加入1mL 0.03% H2O2溶液,反應(yīng)結(jié)束后于510 nm處測(cè)定樣品吸光值[17-19]?？瞻捉M用H2O代替樣品,其余同樣品組。以H2O作空白對(duì)照,VC作陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算清除率。

式(4)

式中:R:·OH清除率,%;A0:空白對(duì)照的吸光度;Ai:·OH與皂莢多糖反應(yīng)后的吸光度;Aj:不加 H2O2的皂莢多糖與無(wú)水乙醇溶液的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于皂莢多糖提取的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ),選定影響多糖得率的4個(gè)因素:提取溫度(X1)、液固比(X2)、提取時(shí)間(X3)、超聲功率(X4),進(jìn)行水平設(shè)定,進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),得到29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的設(shè)計(jì)方案,方案設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示:

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)因素和水平編碼值Table 1 Experimental levels employed for Box-Behnken design

注:采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計(jì)及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)得率的影響 如圖1所示,皂莢多糖得率在超聲提取初期,隨著溫度的增加而增加,在超聲提取過(guò)程中,高溫有助于加劇分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng),加速溶液原料間的相互作用,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)能更好的被破壞,多糖能夠更有效的溶出,得率最大可達(dá)19.23%,但是當(dāng)提取溫度高于50 ℃時(shí),隨后得率不再上升,反呈現(xiàn)出平穩(wěn)下降的趨勢(shì),溫度過(guò)高可使部分糖鏈發(fā)生斷裂,并且影響其生物活性,同時(shí)會(huì)難以控制提取條件。因此,將提取溫度50 ℃選為單因素最佳溫度。

圖1 提取溫度對(duì)皂莢多糖得率的影響Fig.1 Effect of the extraction temperature on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.2 液固比對(duì)皂莢多糖得率的影響 圖2反映了不同的液固比提取對(duì)皂莢多糖得率的影響,由結(jié)果可知,隨著液固比的增加多糖得率有了呈明顯的上升趨勢(shì),當(dāng)液固比為40∶1 (mL/g)時(shí),多糖得率最大可達(dá)19.02%,持續(xù)增大液固比后,多糖得率較為穩(wěn)定。液固比的增加與助于原料的浸提,從而加速多糖的溶出,但溶劑量持續(xù)加大可使固液兩相混合不徹底,傳質(zhì)不均勻,從而造成得率下降。因此,將液固比40∶1 (mL/g)選為單因素最佳液固比。

圖2 液固比對(duì)皂莢多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid/material rate on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)得率的影響 由圖3可知,當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí),皂莢多糖得率最大可達(dá)19.18%,提取時(shí)間高于30 min后,皂莢多糖的得率反而隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。這表明,超聲時(shí)間在一定范圍能是可加速多糖的溶出速度,但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可使超聲空化作用增強(qiáng),機(jī)械力增大,溫度上升,從而將已溶出的多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。因此,將提取時(shí)間30 min選為單因素最佳提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)皂莢多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.1.3 超聲功率對(duì)得率的影響 如圖4所示,當(dāng)超聲功率為250 W時(shí),皂莢多糖提取最大,當(dāng)超聲功率高于250 W時(shí),得率有明顯下降趨勢(shì)。這表明,超聲功率的增大有助于液固兩相的相互混合和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破碎,從而使得率增大,但功率過(guò)強(qiáng),聲波作用加大,機(jī)械力增強(qiáng),將對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞,從而降低多糖的得率[20],同時(shí)也造成了資源的浪費(fèi),因此,將超聲功率250 W選為單因素最佳提取功率。

圖4 超聲功率對(duì)皂莢多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化皂莢多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 回歸模型建立與方差分析 使用Design Expert 8.0.6進(jìn)行的多次數(shù)據(jù)回歸分析,皂莢多糖得率與溫度(X1),液固比(X2),時(shí)間(X3)和超聲功率(X4)的多元二次回歸方程:

表2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and observed responses

表3 回歸方程中各項(xiàng)的方差分析Table 3 Analysis result of variance(ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

圖5 因素交互作用對(duì)皂莢多糖得率的響應(yīng)面結(jié)果Fig.5 Response surface model plots for the interaction effects on the extration rate of polysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.2.2 交互作用分析 圖5為各因素交互作用對(duì)皂莢多糖得率的響應(yīng)面和等高線圖。由圖5(a)可知,隨著提取溫度和提取時(shí)間的增大,皂莢多糖得率呈現(xiàn)出先增高后緩慢降低的趨勢(shì),等高線呈現(xiàn)橢圓形,表明提取時(shí)間與提取溫度兩因素交互作用影響顯著;由圖5(b)表明,隨著提取溫度和超聲功率的增大,皂莢多糖得率呈現(xiàn)出先上升后緩慢下降的趨勢(shì),等高線呈現(xiàn)橢圓形,且曲面較為陡峭,表明提取時(shí)間與超聲功率兩因素交互作用顯著;圖5(c)表明,皂莢多糖得率隨著提取時(shí)間與液固比的增大而呈現(xiàn)出先增大而后平緩下降的趨勢(shì),由等高線圖和響應(yīng)面圖可看出二者交互作用明顯;圖5(d)表明,隨著超聲功率與液固比的增大,得率呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì),曲面圖陡峭,因此二者交互作用具有一定的顯著性。

2.2.3 超聲波提取最佳工藝參數(shù)驗(yàn)證 經(jīng)軟件分析,可得出該模型的最佳工藝條件為:溫度51.46 ℃,液固比36.89∶1 (mL/g),時(shí)間30.39 min,功率286.30 W,在此條件下皂莢多糖得率可達(dá)31.34%。為操作方便可將提取條件調(diào)整為:溫度50 ℃,液固比35∶1 (mL/g),時(shí)間30 min,功率285 W,超聲提取3次,在調(diào)整工藝條件下,平行做三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得率為30.65%±0.25%,結(jié)果和預(yù)測(cè)值誤差較小,表明調(diào)整后的超聲波提取工藝參數(shù)可用。

2.3 皂莢多糖體外抗氧化活性試驗(yàn)

圖6 皂莢多糖對(duì)超氧陰離子的清除作用Fig.6 Superoxide anion radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.3.2 清除DPPH·能力的測(cè)定 由圖7可知,皂莢多糖對(duì)DPPH·的清除能力隨著皂莢多糖濃度的增大而增大,在現(xiàn)有濃度組別試驗(yàn)中,當(dāng)多糖濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到最大值40.2%,IC50值為6.9 mg/mL;陽(yáng)性對(duì)照VC濃度為4 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到最大值95%。

圖7 皂莢多糖對(duì)DPPH·的清除作用Fig.7 DPPH radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

2.3.3 清除羥自由基(·OH)能力 由圖8可知,在現(xiàn)有濃度組別試驗(yàn)中,當(dāng)皂莢多糖濃度為3.5 mg/mL時(shí),皂莢多糖對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到最大值81.6%,IC50值為1.5 mg/mL;當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照VC濃度為4 mg/mL時(shí),VC對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到94%,且其IC50值為0.556 mg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明,皂莢多糖清除請(qǐng)自由基的能力隨著多糖溶液濃度的升高而升高,具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

圖8 皂莢多糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig.8 Hydroxyl radical scavenging capacity ofpolysaccharide in Gleditsiajaponic.miq

3 結(jié)論

本研究選用超聲波法對(duì)皂莢多糖進(jìn)行提取,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)法進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化,并對(duì)所提取的皂莢多糖進(jìn)行體外抗氧化能力測(cè)定。超聲波法優(yōu)化最佳工藝參數(shù)為:溫度50 ℃,液料比35∶1 (mL/g),時(shí)間30 min,功率285 W,在此條件下提取3次,得率為30.65%±0.25%。體外抗氧化研究表明,皂莢多糖對(duì)于羥自由基,DPPH自由基,超氧陰離子均具一定的清除能力,其中對(duì)羥自由基的清除力最強(qiáng),清除超氧陰離子能力最弱,且其抗氧化能力與多糖濃度呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

皂莢多糖的得率及生物活性受品種、產(chǎn)地、提取方法等因素的影響較大,本研究在進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)時(shí)僅進(jìn)行了體外的自由基清除試驗(yàn),但并未對(duì)皂莢多糖在體內(nèi)抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定,也未對(duì)不同方法提取的多糖抗氧化能力進(jìn)行對(duì)比,后續(xù)研究將在抗氧化能力影響因素及體內(nèi)抗氧化能力測(cè)定方面將開(kāi)展進(jìn)一步研究工作。