饒雄輝，羅洪亮，黃俊，朱正明

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer,CRC）是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，到2030年，預(yù)計(jì)將有超過220萬新病例和110萬患者死亡[1-2]。CRC早期癥狀無特異性，許多患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，首次確診就已屬進(jìn)展期[3]。大約50%的患者最后將轉(zhuǎn)歸為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（metastatic colorectal cancer,mCRC）[4]。大部分mCRC患者失去根治性手術(shù)的機(jī)會，預(yù)后不佳。mCRC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案有FOLFOX（奧沙利鉑+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣）和FOLFIRI（伊立替康+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣）及XELOX等，隨著抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子受體（EGFR）的單克隆抗體的研制和投入使用，標(biāo)準(zhǔn)化療聯(lián)合靶向治療使mCRC患者的預(yù)后較前改善[5]。但總體而言，mCRC的預(yù)后仍不理想。近年來，免疫檢查點(diǎn)阻斷療法獲得重要進(jìn)展，針對PD-1/PD-L1途徑的免疫檢查點(diǎn)阻斷療法在治療人類實(shí)體瘤如惡性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌、淋巴瘤、乳腺癌中獲得了顯著療效[6]。2013年，《科學(xué)》雜志將癌癥免疫治療評為2013年的年度突破，免疫治療已成為腫瘤治療的熱點(diǎn)[7]。對CRC而言，PD-1抑制劑Pembrolizumab和Nivolumab已被第七版NCCN指南推薦作為錯(cuò)配修復(fù)缺陷/微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（dMMR/MSI-H）分子表型mCRC的后線治療。然而CRC是一種分子高度異質(zhì)性的疾病，不同分子表型的患者對免疫治療的反應(yīng)可能截然不同，為篩選靶向免疫治療的獲益人群，尋找新的預(yù)測因子成為目前的研究方向之一。

PD-L1也稱為CD274或B7-H1，是PD-1的主要配體，是一種負(fù)性免疫調(diào)節(jié)蛋白。PD-L1常表達(dá)于腫瘤細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和T細(xì)胞等[8-9]。腫瘤通過上調(diào)PD-L1表達(dá)，與PD-1結(jié)合后，抑制T細(xì)胞活化，限制自身免疫的強(qiáng)度，減弱免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視作用，從而發(fā)生免疫逃逸[10-14]。這與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并且是惡性腫瘤預(yù)后不良的潛在原因。PD-L1是CRC潛在的預(yù)測因子，目前已公開發(fā)表的研究針對PD-L1表達(dá)與CRC的預(yù)后關(guān)系的觀點(diǎn)尚有爭議。一部分研究認(rèn)為PD-L1表達(dá)與CRC的不良生存有關(guān)[15-24]，但其他研究的觀點(diǎn)與之相左[25-32]。

為了提供大樣本數(shù)據(jù)來探討PD-L1作為CRC預(yù)測因子的意義價(jià)值，本研究運(yùn)用Meta分析的方法，對已公開發(fā)表的關(guān)于PD-L1表達(dá)與CRC預(yù)后的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，評估CRC中PD-L1表達(dá)的預(yù)后及相關(guān)臨床病理參數(shù)意義。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索策略

系統(tǒng)檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、CNKI和萬方數(shù)據(jù)庫，篩選有關(guān)PD-L1表達(dá)與CRC預(yù)后關(guān)系的研究。檢索時(shí)間截止于2018年6月。檢索詞為“colorectal cancer”、“colorectal tumor”、“colorectal neoplasm”、“colorectal carcinoma”、“colon cancer”、“rectal cancer”、“PD-L1”、“programmed cell death receptor 1 ligand 1”、“CD274”、“B7-H1”、“prognosis”、“prognostic”以及對應(yīng)的中文檢索詞。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）所有納入患者病理確診為結(jié)直腸癌；（2）標(biāo)本來源于腫瘤組織，通過免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry,IHC）方法檢測PD-L1表達(dá)；（3）文中提供了可供分析的生存資料，如OS、RFS或者DFS的HR與其95%CI，探討了PD-L1表達(dá)與CRC預(yù)后和（或）相關(guān)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；（4）納入文獻(xiàn)的出版語言僅限于中文和英文。

1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）病例報(bào)道、綜述、會議摘要、重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；（2）動物試驗(yàn)；（3）無法獲取可供分析的生存資料；（4）標(biāo)本來源于血液。

1.4 數(shù)據(jù)提取

兩位研究人員按設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立地篩選文獻(xiàn)，提取數(shù)據(jù)。出現(xiàn)不同觀點(diǎn)時(shí)，可進(jìn)行小組討論，解決爭議，以減小數(shù)據(jù)提取時(shí)出現(xiàn)的誤差而增大異質(zhì)性，影響最終結(jié)果。首先，去除重復(fù)的文獻(xiàn)，進(jìn)而閱讀文章題目、摘要，以排除不符合本研究要求的文獻(xiàn)，最后閱讀全文，仔細(xì)甄別滿足納入要求的研究。提取的數(shù)據(jù)包括：（1）基本信息：第一作者、國家、出版時(shí)間、抗體類型、隨訪時(shí)間、PD-L1陽性率和截?cái)嘀?；?）相關(guān)臨床病歷資料：各研究性別比例、病例數(shù)；（3）病理特征資料：腫瘤大小、TNM分期、浸潤深度、腫瘤分化程度、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否化療、MSI狀態(tài)、KRAS突變情況等。（3）生存預(yù)后資料：OS（overall survival）、RFS（relapsefree survival）和DFS（disease-free survival）的HR及其95%CI。

1.5 文獻(xiàn)質(zhì)量評價(jià)

使用紐卡斯?fàn)?渥太華量表（NOS）來評估所納入文獻(xiàn)的質(zhì)量，量表包括selection、comparability和outcome assessment三個(gè)參數(shù)，總分為9分，文獻(xiàn)評分在6分以上視為高質(zhì)量。質(zhì)量評估由2名研究人員獨(dú)立進(jìn)行，小組討論解決評分不一致的情況，排除低質(zhì)量文獻(xiàn)后確定最終納入文獻(xiàn)。各納入文獻(xiàn)評分見表1。

表1 納入文獻(xiàn)的一般信息Table1 Baseline characteristics of eligible studies

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其95%CI來評價(jià)PD-L1表達(dá)與結(jié)直腸癌OS、RFS和DFS的關(guān)系，生存數(shù)據(jù)均從文獻(xiàn)中直接獲得。比值比（OR）及其95%CI用于評估PD-L1表達(dá)與結(jié)直腸癌相關(guān)的臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的異質(zhì)性定義為卡方檢驗(yàn)P＜0.1或I2＞50%。假如觀察到異質(zhì)性，我們利用隨機(jī)效應(yīng)模型來減少異質(zhì)性對結(jié)果的影響，否則，使用固定效果模型。Egger’s和Begg’s檢驗(yàn)用于評估發(fā)表偏倚。使用Stata SE12.0軟件進(jìn)行全部的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 納入文獻(xiàn)一般特征

初步檢索得到252篇文獻(xiàn)，首先去除32篇重復(fù)文獻(xiàn)，閱讀題目和摘要后去除122篇，閱讀全文后排除80篇，最終納入18項(xiàng)研究[15-32]。其中12篇來自亞洲[15-19,22-24,26-29]，3篇來自美國[20-21,30]，3篇來自歐洲[25,31-32]。文獻(xiàn)檢索流程見圖1（For more information,visit www.prisma-statement.org）。納入文獻(xiàn)發(fā)表于2013至2018年間，共5 724例CRC患者納入分析，PD-L1陽性率在4.0%至84.6%之間，各文獻(xiàn)一般特征見表1。

2.2 Meta分析結(jié)果

圖1 文獻(xiàn)檢索流程圖Figure1 Flow diagram of literature search and selection

2.2.1 PD-L1表達(dá)與結(jié)直腸癌OS、RFS及DFS的關(guān)系 共11項(xiàng)研究（12個(gè)隊(duì)列）報(bào)道了PD-L1表達(dá)與OS的關(guān)系，納入樣本量為4 032例。結(jié)果提示：與PD-L1陰性組相比，PD-L1陽性表達(dá)與CRC更短的OS相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR:1.40,95%CI:1.02～1.93,P=0.039），見圖2A。共5項(xiàng)研究（6個(gè)隊(duì)列）報(bào)道PD-L1表達(dá)與RFS的關(guān)系，納入樣本量為1 425例。結(jié)果提示PD-L1表達(dá)與CRC較短的RFS有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR:1.67,95%CI:1.27～2.20;P=0.000），見圖2B。4項(xiàng)研究報(bào)道了PD-L1表達(dá)與DFS的關(guān)系，共785例樣本。結(jié)果提示PD-L1表達(dá)與DFS無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)（HR:1.16,95%CI:0.60～2.27,P=0.659），見圖2C。在關(guān)于OS（I2=86.0%）和DFS（I2=81.0%）的分析中觀察到高異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型，而關(guān)于RFS（I2=41.6%）的分析中無高異質(zhì)性，則采用固定效應(yīng)模型。

2.2.2 PD-L1表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系 從性別、腫瘤位置、TNM分期、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、化療、MSI狀態(tài)、KRAS突變等10個(gè)方面分析PD-L1表達(dá)與CRC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果提示：PD-L1表達(dá)與腫瘤分化（OR:1.56,95%CI:1.09～2.22,P=0.016）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（OR:0.82,95%CI:0.69～0.98,P=0.028）有關(guān)。而在性別（OR:1.06,95%CI:0.87～1.28,P=0.569）、腫瘤位置（OR:1.09,95%CI:0.53～2.24,P=0.816）、TNM分期（OR:1.18,95%CI:0.66～2.11,P=0.582）、浸潤深度（OR:0.95,95%CI:0.67～1.34,P=0.767）、血管侵犯（OR:0.78,95%CI:0.43～1.42,P=0.419）、化療（OR:0.95,95%CI:0.65～1.40,P=0.803）、MSI狀態(tài)（OR:2.4,95%CI:0.69～8.3,P=0.168）、KRAS突變（OR:0.99,95%CI:0.75～1.31,P=0.946）等方面，PD-L1表達(dá)與其無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)，見圖3、表2。

2.2.3 亞組分析 PD-L1表達(dá)與OS相關(guān)性分析中，觀測到顯著異質(zhì)性（I2=86.0%），為明確異質(zhì)性來源，我們按種族、抗體類型、抗體來源、免疫染色位置、HR評估、樣本大小分組，亞組分析結(jié)果提示在腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)（HR:1.40,95%CI:1.03～1.90）多克隆抗體（HR:2.13,95%CI:1.36～3.35）及單因素分析（HR:1.40,95%CI:1.36～2.65）亞組中，PD-L1表達(dá)與OS的關(guān)聯(lián)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且在多克隆抗體（I2=46.7%）及單因素分析（I2=0.0%）亞組中，異質(zhì)性顯著下降，由此推斷抗體類型及HR評估類型是PD-L1表達(dá)與OS相關(guān)性分析中的主要異質(zhì)性來源。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中的表達(dá)與OS的關(guān)系存在不一致性，為進(jìn)一步探討這一現(xiàn)象，按免疫染色位置不同也對PD-L1表達(dá)與RFS的關(guān)系進(jìn)行亞組分析，結(jié)果證實(shí)腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與較短的RFS有關(guān)（HR:2.46,95%CI:1.44～4.20），而腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中的表達(dá)與RFS（HR:1.39,95%CI:0.83～2.32）無統(tǒng)計(jì)學(xué)的關(guān)聯(lián)，見表3。

圖2 PD-L1表達(dá)與結(jié)直腸癌生存關(guān)系的Meta分析森林圖Figure2 Meta-analysis of relation between PD-L1 expression and prognosis of colorectal cancer

圖3 PD-L1表達(dá)與相關(guān)臨床病理參數(shù)關(guān)系的Meta分析Figure3 Forest plots of correlation between PD-L1 expression and clinicopathological characteristics

2.2.4 發(fā)表偏倚及敏感度分析 使用Egger's test和Begg's test來評估發(fā)表偏倚。Begg's試驗(yàn)結(jié)果表明在評估OS的研究中存在潛在的發(fā)表偏倚（Begg's test,Pr＞|z|=0.041），而Egger's試驗(yàn)結(jié)果與之相反，提示沒有發(fā)表偏倚（Egger's test,Pr＞|z|=0.945）。對于此矛盾，進(jìn)一步的Begg's圖顯示出不對稱性，這支持了Begg's試驗(yàn)的結(jié)論，見圖4A。發(fā)表偏倚存在的原因可能是由于陽性結(jié)果相比陰性結(jié)果更容易發(fā)表。當(dāng)研究數(shù)量少于10項(xiàng)時(shí)，定性和定量檢測的敏感度很低，因此我們沒有評估RFS和DFS的發(fā)表偏倚[33]。

采用Stata SE12.0軟件對OS進(jìn)行敏感度分析，逐次剔除1篇文獻(xiàn)，制作森林圖來評估各項(xiàng)研究對合并結(jié)果的影響。森林圖提示在剔除任何一項(xiàng)研究后，對合并的HR和95%CI均沒有顯著影響，表明Meta分析結(jié)果的穩(wěn)定性，見圖4B。

3 討論

抑制性受體的表達(dá)可以激活共刺激因子的活性，限制T細(xì)胞的遷移、增殖和細(xì)胞毒性介質(zhì)的釋放，從而阻止過度的自身免疫、炎性反應(yīng)和避免組織損傷，是人體的一種免疫保護(hù)機(jī)制。然而，腫瘤通過上調(diào)抑制性受體的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制效應(yīng)，造成效應(yīng)T細(xì)胞衰竭，限制由CD4+和CD8+T細(xì)胞引發(fā)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，最終可能導(dǎo)致免疫逃逸或耐受。PD-L1是其中的一種抑制性受體，已被證實(shí)選擇性表達(dá)于腫瘤部位，這種特點(diǎn)使“腫瘤靶向”免疫調(diào)節(jié)成為可能[34]。針對PD-1/PD-L1轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的免疫療法通過阻止PD-1與PD-L1結(jié)合，釋放T細(xì)胞的功能，恢復(fù)正常的免疫應(yīng)答，并重新識別和攻擊腫瘤細(xì)胞，達(dá)到抗腫瘤的效果。腫瘤上調(diào)PD-L1表達(dá)是逃脫免疫攻擊，繼而播散、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要方式，可能與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。但是，現(xiàn)有的研究表明腫瘤組織中的PD-L1表達(dá)對結(jié)直腸癌的預(yù)后意義仍存在爭議，因此，我們進(jìn)行Meta分析來探討使用PD-L1表達(dá)來預(yù)測CRC預(yù)后是否可行。

表2 PD-L1表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table2 Correlation of PD-L1 expression with clinicopathological characteristics

表3 PD-L表達(dá)與OS、RFS的關(guān)系亞組分析結(jié)果Table3 Main Subgroup analysis results

圖4 PD-L1表達(dá)與OS關(guān)系的偏倚(A)及敏感度(B)分析圖Figure4 Begg’s plots(A) and sensitivity(B) analyses of relationship between PD-L1 expression and OS

雖然已存在關(guān)于PD-L1與CRC預(yù)后關(guān)系的薈萃分析，但從納入文獻(xiàn)數(shù)量、分析模型及效應(yīng)量選擇等方面還有待商榷。Wu等[35]在2015年發(fā)表的關(guān)于PD-L1與人類實(shí)體瘤預(yù)后關(guān)系的Meta分析中，表明在CRC亞組中，PD-L1表達(dá)與5年OS下降有關(guān)，由于使用OR替代HR來評估腫瘤生存指標(biāo)，且僅納入2項(xiàng)研究，這可能會增加研究的偏倚。在另外3篇[36-38]有關(guān)的Meta分析中，PD-L1表達(dá)與CRC預(yù)后無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。由于不是針對性研究CRC，存在相關(guān)納入研究數(shù)量較少的特點(diǎn)。

本研究的預(yù)后分析結(jié)果顯示PD-L1表達(dá)與OS和RFS下降相關(guān)。相關(guān)臨床病理參數(shù)分析結(jié)果顯示PD-L1的表達(dá)水平與腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而腫瘤分化差與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是CRC不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。這些證據(jù)都支持PD-L1陽性表達(dá)與CRC更短的生存相關(guān)，可作為CRC的預(yù)后預(yù)測因子。亞組分析結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)、多克隆抗體及單因素分析亞組與OS降低相關(guān)，且多克隆抗體及單因素分析亞組中異質(zhì)性顯著下降，由此推斷抗體類型及HR評估類型可能是PD-L1表達(dá)與OS相關(guān)性分析中的主要異質(zhì)性來源。而且，從亞組分析結(jié)果分析，腫瘤細(xì)胞中PD-L1與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與OS及RFS的關(guān)系是不一致的，僅前者與不良的OS及RFS有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。

事實(shí)上，在腫瘤組織中，PD-L1可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞（tumor infiltrating immune cells,TILs）中[39]。TILs的產(chǎn)生是一種適應(yīng)性免疫反應(yīng)，它在控制人類腫瘤生長和復(fù)發(fā)中的作用存在爭議[40]。有研究表明TILs可以促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移[41-42]。此外，TILs雖然在體外具有增殖和清除腫瘤細(xì)胞的作用，但在體內(nèi)，由于腫瘤微環(huán)境中存在免疫抑制性骨髓細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)分子上調(diào)所形成的免疫抑制性微環(huán)境，使得T細(xì)胞難以發(fā)揮其作用[43-44]。本研究的分析結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞與TILs中的PD-L1表達(dá)對CRC預(yù)后的影響存在不一致性，但限于納入的關(guān)于TILs的研究較少，對此結(jié)果還需謹(jǐn)慎對待，需要更多的設(shè)計(jì)良好的隊(duì)列研究來論證腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)對CRC預(yù)后的影響。

與以往的Meta分析相比，本研究存在以下優(yōu)勢：（1）納入研究及樣本量大，增加了Meta分析的檢驗(yàn)效能；（2）探究了腫瘤細(xì)胞與腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞中PD-L1表達(dá)對CRC預(yù)后影響的異同；（3）數(shù)據(jù)由納入文獻(xiàn)直接給出，而非從生存曲線中提取，減小了誤差；（4）敏感度分析證明了結(jié)果的穩(wěn)定性。這些特點(diǎn)增加了此Meta分析結(jié)果的可信度。盡管如此，我們的研究仍存在不足：（1）各納入研究進(jìn)行免疫組織化學(xué)所使用的抗體類型存在不同，判斷PD-L1陽性的截?cái)嘀担╟utoff value）標(biāo)準(zhǔn)多樣（見表1），沒有對截?cái)嘀颠M(jìn)行亞組分析是本文的缺憾之處，這可能會增加研究的偏倚；（2）不同分子表型的CRC對免疫治療的反應(yīng)不一。由于缺乏原始研究數(shù)據(jù)的支持，此Meta分析未對不同分子表型進(jìn)行亞組分析。

綜上所述，腫瘤組織中PD-L1表達(dá)與CRC較短的OS及RFS、腫瘤分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤細(xì)胞與腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)對CRC預(yù)后的預(yù)測意義可能不一致。