高 凡,張旭升,王 敏,張鈞煜,王 平
(1.浙江大學 生物醫(yī)學工程與儀器科學學院,浙江 杭州 310027; 2.南京航空航天大學 自動化學院,江蘇 南京 210016)
氫(H2)呼氣試驗已被世界各國專家廣泛應用于診斷碳水化合物吸收不良、小腸細菌過度生長(small intestinal bacterial overgrowth, SIBO)等病癥,因其具有簡便、迅速及無創(chuàng)等優(yōu)點,現已作為一種非侵入性胃腸功能的常規(guī)檢查方法[1-4].小腸中存在的產甲烷菌會利用氫和二氧化碳生產甲烷,若在氫呼氣試驗中同時進行對甲烷含量的測定,對排除假陰性結果及提高相關疾病的確診率將更有意義[5-7].現階段甲烷和氫的呼氣檢測一般采用氣相色譜技術、電化學技術、固態(tài)傳感器技術等檢測手段.氣相色譜儀是一種用于精確分離復雜樣品中化合物的化學分析儀器,但是由于設備復雜昂貴,所需檢查時間較長,因而難以實現多樣本、大數據的檢測需求[8].而電化學技術使用的氫氣傳感器是一種化學燃料電池,利用呼出氣體中的氫與傳感器中的化學物質發(fā)生反應,把產生的能量轉化成電流.但是由于在檢測氣體時要消耗傳感器內的化學物質,隨著檢測次數的增加,其結果的穩(wěn)定性和敏感性將逐漸降低[9].上述技術都難以滿足甲烷和氫呼氣檢測的實際需求.
為了實現大規(guī)模的臨床應用,需要提出一種可以同時檢測氫體積分數φ(H2)、甲烷體積分數φ(CH4)和二氧化碳體積分數φ(CO2)的小型一體化檢測儀器,其應具有快速方便、數據準確、性能穩(wěn)定和可重復性高等優(yōu)點,并能根據二氧化碳體積分數修正檢測值,降低樣本采集限制條件,減少呼氣采集等人為因素造成的誤差.
虛擬電子鼻系統(tǒng)基于氣相色譜原理,簡化了大型氣相色譜設備的復雜結構,其硬件系統(tǒng)主要包括進樣通路、清洗通路及檢測通路三個部分.當兩相三通電磁閥位于實線導通狀態(tài)時,干燥管、計量環(huán)、流量計、精密流量調節(jié)閥、進樣氣泵依次連通構成進樣通路.其中,干燥管內填充硅膠顆粒,用于濾除呼出氣體中的水分,以消除濕度對傳感器響應引起的誤差.當管內三分之二的硅膠顆粒由藍色變?yōu)榉凵珪r,需重新填充.計量環(huán)用于定量存儲樣本氣體,流量計與精密流量調節(jié)閥用于檢測和調節(jié)氣路流量,進樣氣泵提供負壓以抽取氣袋中的樣本氣體.過濾瓶、過濾塞、載氣氣泵(風扇)、精密流量調節(jié)閥、流量計、色譜柱、檢測氣室依次連通構成清洗通路.其中,過濾瓶內裝有活性炭、硅膠顆粒、分子篩,用于過濾室內空氣中的雜質分子以獲得潔凈的空氣作為載氣,以便持續(xù)清洗色譜柱與氣室.過濾塞裝有孔徑為25 μm的纖維濾膜,以濾除大顆粒物質,避免堵塞氣泵與色譜柱.載氣氣泵配有測溫模塊,通過溫度反饋來調節(jié)風扇轉速從而冷卻氣泵溫度.
當兩相三通電磁閥同時切換至虛線導通狀態(tài)時,各部件構成檢測通路,計量環(huán)中的樣本被載氣推入色譜柱中,分離后的各組分分別被紅外激光傳感器(GSS-SprintIR)與金屬氧化物半導體(metal oxide semiconductor, MOS)傳感器(TGS813)檢測后,得到φ(H2)、φ(CH4)和φ(CO2),檢測結果可顯示于儀器的液晶屏上或通過熱敏打印模塊打印,也可通過串口或USB接口傳輸至上位機,再進行后續(xù)的數據分析.一次檢測完成后,兩相三通電磁閥再次切換至實線通路,儀器進入清洗狀態(tài),等到傳感器響應恢復到基線值后,可進行下一次進樣與檢測.虛擬電子鼻系統(tǒng)結構原理如圖1(a)所示,硬件實物如圖1(b)所示.
檢測氣室為長方體結構,一面上部開有二氧化碳傳感器槽,另一面開有二氧化碳傳感器通氣口與MOS傳感器槽,其底部開有圓柱形槽,構成氣體反應室,反應室覆蓋MOS傳感器的敏感材料.氣體反應室內部形成微小空間,經色譜柱分離后的氣體各組分經過進氣口,從氣體反應室的頂部垂直流向MOS傳感器表面,并從側壁連通的出氣口排出,以保證MOS傳感器快速給出輸出響應,并在短時間內恢復至基線.其中,二氧化碳傳感器選用英國GSS公司SprintIR系列的高速紅外激光傳感器,采樣頻率可達20 Hz,功耗僅為35 mW,φ(CO2)測量范圍為1%~20%,精確度為70×10-6.氫氣和甲烷傳感器選用日本FIGARO公司TGS813系列的MOS傳感器,其對可燃燒氣體有著較好的靈敏度,對呼出氣體中除氫氣與甲烷之外的大部分成分沒有明顯響應.
檢測氣室另一側壁開有測溫孔(Pt100).檢測氣室整體為金屬材質,以保證較大的熱慣性,頂面開有控溫模塊裝配孔,控溫模塊包含加熱器與過溫保護開關.其中加熱器與Pt100實現對檢測氣室的測溫與控溫,系統(tǒng)通電后,加熱器對檢測氣室進行升溫,溫度傳感器實時測量檢測氣室的溫度作為反饋值,通過PID控溫算法把溫度控制在合適的恒定值,以盡可能抑制溫度漂移對傳感器輸出造成的影響.當溫度過高時,保護開關自動斷開以保護傳感器不受損壞.檢測氣室結構設計如圖2所示.
圖1 虛擬電子鼻系統(tǒng)
圖2 檢測氣室結構設計
根據一般人體呼出氣體中φ(CO2)和胃腸道疾病病人呼出氣體中φ(H2)和φ(CH4)[10-11],設定虛擬電子鼻對φ(H2)、φ(CH4)檢測范圍均為1×10-6~500×10-6,分辨率為1×10-6;對φ(CO2)檢測范圍為0.1%~10%,分辨率為0.1%.筆者利用標準氣體對傳感器進行標定,選用1 000×10-6的氫氣與甲烷標準氣體,使用計量法配置高濃度梯度(200×10-6~500×10-6)、中濃度梯度(20×10-6~180×10-6)、低濃度梯度(2×10-6~10×10-6),分別對傳感器進行測試,每種濃度重復測量7次,每次檢測提取峰值與基線并計算兩者的差值,7次測量差值的平均值作為特征參數,分析特征值與濃度梯度的相關性,取相關系數R2最優(yōu)的擬合結果作為標定公式.由于虛擬電子鼻受到環(huán)境與自身系統(tǒng)穩(wěn)定性和隨機噪聲的影響,需在首次通電或檢測了一定數量的樣本后,使用特殊配置的標準氣體(背景氣體:潔凈空氣),φ(H2)=144×10-6,φ(CH4)=74×10-6,φ(CO2)=6.1%,對儀器進行校準并修正標定公式.
筆者選擇SIBO作為代表性的胃腸道疾病.SIBO甲烷氫呼氣試驗一般服用乳果糖作為底物,根據檢測者體重計算服用底物量,空腹服用底物0.5 h后開始測量,3 h內每隔20 min采集一次呼氣樣本,共計10個樣本[12-13].使用儀器分別檢測樣本中φ(H2)、φ(CH4)的修正值,并繪制濃度隨時間的變化曲線.選取醫(yī)院提供的健康人與SIBO病人的樣本進行檢測與分析,對比兩者的差異性,初步搭建SIBO診斷模型.
檢測氣室溫度與載氣氣路流量是影響虛擬電子鼻系統(tǒng)檢測結果準確性和穩(wěn)定性的兩個關鍵因素.控制檢測氣室溫度恒定可避免呼出氣體冷凝現象并抑制傳感器輸出響應的溫度漂移.經測試,開機預熱2 h后,檢測氣室溫度穩(wěn)定在38 ℃±0.5 ℃,MOS傳感器輸出響應達到穩(wěn)定狀態(tài),基線漂移小于50 mV.系統(tǒng)通電后自動進入預熱狀態(tài),程序判斷出溫度穩(wěn)定在設置的范圍后,允許系統(tǒng)進入主菜單.在運行過程中,當氣室溫度異常時,程序自動跳入預熱界面,禁止其他所有操作.氣室控溫與傳感器基線漂移曲線如圖3所示.
圖3 氣室控溫與傳感器基線漂移曲線
虛擬電子鼻系統(tǒng)傳感器對氫氣和甲烷混合氣體輸出響應為雙峰結構,經過色譜柱分離后,氫氣先從色譜柱中流出,甲烷隨后流出.MOS傳感器分別對氫氣和甲烷產生響應,響應峰值的時間點代表檢測的物質,響應峰值的大小反應檢測物質的濃度.載氣氣路流量對MOS傳感器輸出響應和雙峰結構有著顯著影響,分別設置5種不同的載氣氣路流量,對φ(H2)=200×10-6(背景氣體:潔凈空氣)的樣本多次測量,觀察流量對傳感器輸出響應的影響,如圖4所示.可以看出,流速較大時,出峰較快,峰值響應較大,但氫氣峰與甲烷峰之間重疊較多,即傳感器在與氫氣反應后,未恢復基線時就與甲烷開始反應,致使檢測結果誤差較大;流速較小時,兩個特征峰分離較開,但峰值響應較小,恢復基線時間較久,致使單次檢測周期過長,不利于大樣本分析.綜合考慮檢測準確性與檢測周期,設置當載氣氣路流量在60 mL/min±3 mL/min的范圍內時,允許儀器進入檢測狀態(tài).當儀器運行過程中載氣氣路流量異常時,儀器顯示錯誤界面,需調整精密流量閥或檢查氣路,使流量恢復正常后才能進行其他操作.
圖4 載氣氣路流量對傳感器輸出響應的影響
人體呼吸節(jié)律過程中,與血液中氣體發(fā)生交換的肺泡氣含有較多的代謝物質.在采集樣本時,待測者一次呼氣的不同階段所含氫氣、甲烷含量不同,φ(H2)檢測值如圖5(b)(修正前)所示.可以看出,測量結果可比性較差,不利于診斷分析.現階段檢測技術與設備對采氣限制條件較多,很難保證完全獲取肺泡氣,從而增加操作復雜度并影響推廣.筆者設計的檢測系統(tǒng)可同步測量樣本中的φ(CO2),并對φ(H2)、φ(CH4)檢測值進行修正.
預設φ(CO2)期望值為5.5%(該值為一般人體肺泡氣二氧化碳體積分數).φ(CO2)期望值除以φ(CO2)檢測值后得到修正因子,修正后的φ(H2)、φ(CH4)等于φ(H2)、φ(CH4)檢測值乘以修正因子.呼出氣體中φ(CO2)與修正因子如圖5(a)所示,呼出氣中的φ(CO2)和計算后得到的修正因子隨不同的呼氣階段(如死腔氣體與肺泡氣等)呈周期性變化.φ(H2)的二氧化碳修正結果如圖5(b)所示,呼出氣中的φ(H2)隨φ(CO2)的變化而變化,修正后的φ(H2)被歸一化到同一水平,消除了不同呼氣階段造成的差異.該修正方法有利于降低樣本采集限制條件,減少呼氣采集等人為因素造成的誤差,使檢測結果更具可比性,為相關疾病的初篩與診斷提供更可靠的檢測數據.
圖5 二氧化碳修正曲線
對虛擬電子鼻系統(tǒng)MOS傳感器進行標定,甲烷濃度梯度響應曲線如圖6所示.MOS傳感器輸出響應形成雙峰曲線,依次為氫氣特征峰與甲烷特征峰,雙峰之間間隔較大,氫氣響應恢復基線后再與甲烷開始反應,甲烷反應后快速恢復基線,整體單次測量周期為90 s.氫氣與甲烷特征峰位置重復性良好,峰值與濃度呈明顯正相關.低濃度梯度響應與中高濃度梯度響應相比,因為信噪比降低,曲線更為粗糙,甲烷特征峰區(qū)分不明顯,可通過單獨增加放大倍數加以改進.
圖6 虛擬電子鼻氫氣與甲烷濃度梯度響應曲線
圖7 虛擬電子鼻響應與濃度梯度相關性分析
提取多次測量的傳感器響應峰值作為特征參數,氫氣和甲烷的高濃度與低濃度梯度相關性分析分別如圖7所示.取相關系數(R2)最優(yōu)的擬合結果作為標定公式,氫氣標定公式為二次曲線,甲烷標定公式為線性曲線,4組公式的R2均大于0.99,線性擬合度良好.測試樣本時,將傳感器輸出響應帶入標定公式后可計算出φ(H2)、φ(CH4)檢測值.根據人體呼出氣體中φ(CO2)范圍,設定修正因子小于4時,所測φ(CO2)有效,并對φ(H2)、φ(CH4)檢測值進行修正.虛擬電子鼻系統(tǒng)對φ(H2)、φ(CH4)的檢測范圍均為1×10-6~500×10-6,分辨率為1×10-6,滿足一般患者呼出氣內φ(H2)、φ(CH4)所需檢測范圍和靈敏度.
選擇SIBO作為代表性的胃腸道疾病,選取健康人與SIBO病人的樣本進行檢測與分析.檢測者在空腹時根據自身體重服用一定量的乳果糖,3 h內采集10次樣本,使用儀器分別檢測樣本中φ(H2)、φ(CH4)的修正值,繪制濃度隨時間的變化曲線,建立SIBO診斷模型,包含檢測數據、模型分析、參數設置等功能的上位機軟件界面如圖8所示.健康人小腸段中細菌較少,乳果糖不被消化吸收,φ(H2)、φ(CH4)維持在基線水平,1~2 h后,乳果糖到達結腸段被細菌分解產生氫氣,產甲烷菌結合氫氣與二氧化碳產生甲烷,φ(H2)、φ(CH4)顯著上升(對照組).SIBO病人的曲線趨勢主要分為單峰模型和雙峰模型.單峰模型中,φ(H2)、φ(CH4)、φ(H2)+φ(CH4)相較于基礎值至少分別上升了20×10-6、6×10-6、24×10-6,且起始上升時間(St)在90 min之前.雙峰模型中,首次出現峰(Pv1)的時間點(St1)至少在90 min之前,φ(H2)、φ(CH4)、φ(H2)+φ(CH4)相較于基礎值至少分別上升了12×10-6、4×10-6、14×10-6,且短暫回落基線后出現峰值更高的結腸峰(Pv2).
圖8 SIBO診斷模型與軟件界面
此外,如果在服用乳果糖之前,φ(H2)、φ(CH4)的基礎值分別大于20×10-6、10×10-6,且每隔20 min連續(xù)測3次的φ(H2)、φ(CH4)均大于20×10-6、10×10-6,則也判斷為SIBO陽性.但如果較高的φ(H2)、φ(CH4)基礎值在1 h內有顯著的下降,則考慮為禁食不充分,需3~5 d后禁食重新測量.
本研究設計了基于虛擬電子鼻的甲烷氫呼氣胃腸道功能檢測系統(tǒng),使用標準氣體標定傳感器,并分析輸出響應特征值與濃度梯度相關性,得出標定公式,選用實際呼氣樣本驗證儀器準確性與穩(wěn)定性,并分析健康人與SIBO病人呼氣中φ(H2)、φ(CO2)曲線的差異,初步建立SIBO診斷模型.與現有設備和技術相比,該系統(tǒng)具有以下特點與優(yōu)勢:
(1)φ(CO2)的同步檢測與修正.根據φ(CO2)濃度修正后的φ(H2)、φ(CH4)被歸一化到同一水平,消除了不同呼氣階段造成的差異,減少呼氣采集等人為因素造成的誤差,為相關疾病的初篩與診斷提供更可靠的檢測數據;
(2)獨特的檢測氣室結構.樣本中各組分從氣體反應室的頂部垂直流向MOS傳感器表面,并從側壁連通的出氣口排出,MOS傳感器快速給出輸出響應,并在短時間內恢復基線,單次檢測周期較短;
(3)精確的氣路流量控制.設置最佳的進樣流量使樣本短時間內自動充滿計量環(huán).設置最優(yōu)的載氣流量使氫氣與甲烷特征峰相互分離無重疊,且在短時間內恢復基線,進一步縮短單次檢測周期,以滿足臨床大樣本量的檢測需求;
(4)利用儀器搭建診斷模型.儀器實現無創(chuàng)、快速檢測呼出氣體中φ(H2)、φ(CH4),準確性與穩(wěn)定性良好.載氣為過濾后的空氣,無需特殊高純氣體,減少氣瓶、壓力轉換與控制等部件的體積與復雜度,提高使用安全性.整體操作簡便,用戶交互友好,分析實際樣本初步搭建SIBO診斷模型.
未來可進一步增加健康人與病人檢測樣本量,拓展胃腸道疾病檢測種類,增加檢測標志物,實現一體化多疾病綜合檢測系統(tǒng),建立更為豐富智能的診斷模型,通過大數據分析制定疾病診斷標準.由此搭建胃腸道疾病檢測中心或聯合大型醫(yī)院與社區(qū)醫(yī)院形成胃腸道疾病診療網絡,實現云平臺數據共享、實時在線診斷等信息交互功能.
呼氣試驗是一種日漸流行的胃腸道功能檢測方法,在用于診斷SIBO等胃腸道疾病有著廣泛的應用.筆者介紹了一種基于虛擬電子鼻的胃腸道功能檢測系統(tǒng),可檢測人體呼出氣體中φ(H2)、φ(CH4)和φ(CO2).由過濾后的室內空氣作為載氣,持續(xù)清洗色譜柱與檢測氣室,檢測氣室配有測溫與控溫模塊,維持氣室溫度為38 ℃±0.5 ℃,使傳感器基線漂移小于50 mV.自動進樣并切換兩相三通閥后,計量環(huán)中的待測樣本被載氣推入色譜柱進行分離,混合氣體中的各組分分別被傳感器檢測.虛擬電子鼻經過標準氣體標定后,分析輸出響應與濃度梯度的相關性,取相關系數(R2)最優(yōu)的擬合結果作為標定公式,由此計算得出φ(H2)、φ(CH4),并可根據φ(CO2)進行修正,消除死腔氣體的影響.該系統(tǒng)對φ(H2)、φ(CH4)檢測范圍均為1×10-6~500×10-6,分辨率可達1×10-6.對健康人與病人樣本進行分析,建立SIBO診斷模型.筆者設計的檢測系統(tǒng)具有特異性高、重復性與穩(wěn)定性良好、無創(chuàng)且操作便捷等優(yōu)勢,在未來可用于大規(guī)模的臨床與家庭病人的數據采集與診斷分析.