王清碧，唐 農(nóng)，吳 林，蔡鑫昆，畢信亞，李天威，李海沅，趙清山

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；4.鹽城市中醫(yī)院，江蘇 鹽城 224001；5.馬鞍山市中醫(yī)院，安徽 馬鞍山 243012）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由各種腦血管病引起的獲得性、持續(xù)性智能損害綜合征，臨床中最突出的表現(xiàn)是學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能的下降。在發(fā)達國家中VD占全部癡呆患者的25%～50%，成為導(dǎo)致癡呆的第二大原因［1］。在所有的癡呆類型中，從某種程度上講，血管性癡呆是可以防治的［2］。伴隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高以及老齡化社會的到來，血管性癡呆的發(fā)病率越來越高，一方面給老年患者的身心健康帶來嚴(yán)重的危害，另一方面也給家庭和社會帶來繁重的經(jīng)濟和精神負(fù)擔(dān)，因此，預(yù)防和治療血管性癡呆受到越來越多人的關(guān)注。本實驗參照呂氏造模方法［3］，采用兩側(cè)頸總動脈夾閉再通法制備VD 模型，通過Tunel法檢測神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，Western Blot檢測VD大鼠海馬CA1 區(qū)cAMP∕PKA-CREB 信號通路相關(guān)因子p-CREB 和CREB 的蛋白表達，觀察益肺宣肺降濁方對血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及p-CREB 和CREB蛋白表達的影響?，F(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 SPF 級SD 雄性大鼠190 只，體質(zhì)量200±20 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：43004700002251。

1.2 主要藥品及試劑 益肺宣肺降濁方免煎顆粒（相當(dāng)于含生藥量：黃芪15 g、人參15 g、麥冬15 g、桔梗10 g、杏仁10 g、三七15 g、蘇子15 g、石菖蒲15 g、酒大黃6 g），由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；石杉堿甲片（商品名“雙益平”，國藥準(zhǔn)字H10960133，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司）；p-CREB抗體（批號4276，美國Santa Cruz 公司）；CREB 抗體（批號4820，美國Santa Cruz 公司）；二抗（兔抗山羊，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要器材 D700 型照相系統(tǒng)（日本NIKON）；BX60 型顯微鏡（OLYMPUS）；DW-86L490 型-80 ℃冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；BCD-268WBCS 型20 ℃冰箱（青島海爾股份有限公司）；HYC-326A 型4 ℃冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；50121224 型離心機（THERMO FISHER 公司）；全自動石蠟切片機（德國MICRO）；轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司）；電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；電熱恒溫水浴槽（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）。

2 實驗方法

2.1 造模方法 參考文獻［3］方法造模：動物于術(shù)前8 h 禁食，予10%水合氯醛3 ml∕kg 腹腔注射麻醉。所有的手術(shù)器械先高溫滅菌，固定好大鼠，然后頸部去毛，碘伏消毒后，行頸正中切口，依次應(yīng)用玻璃分針分離出雙側(cè)頸總動脈并用0 號絲線結(jié)扎，手術(shù)過程中注意不要牽拉迷走神經(jīng)，阻斷血流20 min，同時在大鼠距尾尖1 cm處斷尾，放血約0.3 ml，然后松開絲線恢復(fù)大腦血流10 min，再次阻斷血流20 min，如此重復(fù)3次，即3 次缺血20 min、再灌注10 min 的方式，造成VD模型。第3 次血流再灌注后，切口給予適量頭孢粉末預(yù)防感染，隨即行皮膚縫合，放回籠中正常飼養(yǎng)?？瞻捉M只分離雙側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎也不阻斷。

2.2 VD 模型篩選 造模10 天后進行VD 模型篩選，按照上述定位航行實驗方法，參照趙憲林等［4］的VD大鼠模型篩選標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，即以空白組大鼠逃避時間的均值為參考值，計算造模大鼠各時段成績的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時間的比例，該比例＞20%即可定為VD大鼠。

2.3 分組及給藥 將造模成功大鼠隨機分為中藥高、中、低劑量組，石杉堿甲組，模型組，每組20 只。另取22 只作為空白組。在造模第20 天開始灌胃給藥，給藥量均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定，以臨床人用藥等效劑量作為中劑量。經(jīng)過計算后，中藥高、中、低劑量組大鼠的給藥劑量分別為24.36 g∕（kg·d）、12.18 g∕（kg·d）、6.09 g∕（kg·d），石杉堿甲組給藥劑量為0.15 mg∕（kg·d），所有藥物均用雙蒸水溶解，給藥濃度按照上述的給藥劑量折算至每天按10 ml∕kg大鼠體重灌胃。模型組和空白組給予相應(yīng)體積（10 ml∕kg）的雙蒸水。每天給藥1次，30 d后制取標(biāo)本。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 Tunel 法檢測取材 行為學(xué)測試結(jié)束后，每組取6只大鼠，用10%的水合氯醛按0.3 g∕kg的用量腹腔注射麻醉，快速開胸暴露大鼠心臟，剪開右心耳，夾持心尖，將粗針頭經(jīng)左心室插入升主動脈，用動脈夾將針頭固定?？焖俚稳?7 ℃生理鹽水100～250 ml 沖洗大鼠體內(nèi)血液，直至右心耳處流出淺白色液體或液體基本澄清。隨即灌注4 ℃4%多聚甲醛，先快速灌入約30 s，然后緩慢灌注，直至大鼠頭部變硬，四肢震顫后停止灌注。然后立即斷頭取腦，分離出雙側(cè)海馬放入4%多聚甲醛中固定。然后經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、連續(xù)冠狀切片，片厚約5 μm，采用Tunel法檢測海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡。

2.4.2 p-CREB 和CREB 的檢測 行為學(xué)測試后，采取斷頭低溫新鮮取腦，然后放入-80 ℃液氮中保存?zhèn)溆?。?80 ℃保存的新鮮組織提取總蛋白，用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。每孔上樣量為30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜，于含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉；置裝有稀釋好的一抗工作液的雜交袋中過夜，PBS洗膜3次，每次15 min；加二抗于室溫孵育2 h后曝光，觀察結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3 組以上計量資料比較用單因素方差分析，所有的統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 Tunel熒光檢測大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 結(jié)果見圖1及表1。

結(jié)果顯示，神經(jīng)元凋亡（Tunel 陽性細(xì)胞）以綠色熒光表示，空白組偶見陽性細(xì)胞，僅有少量細(xì)胞凋亡；模型組陽性細(xì)胞明顯增多，簇?fù)沓蓤F狀，跟空白組比較神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少，有顯著性差異（P＜0.01）；中藥隨著劑量的增加，其改善海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用越明顯，呈劑量正相關(guān)（P＜0.01），其中高劑量組與石杉堿甲組作用相當(dāng)（P＞0.05）。

圖1 各組神經(jīng)元凋亡熒光染色圖

表1 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目（±s）

表1 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目（±s）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與石杉堿甲組比較，③P＜0.01；與中藥高劑量組比較，④P＜0.01

組別空白組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組石杉堿甲組n 6 6 6 6 6 6神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目19.16±11.58 118.33±31.41①③④26.66±10.32②49.16±11.58①②③④71.66±10.80①②③④30.00±14.14②

3.2 各組大鼠海馬組織p-CREB與CREB蛋白含量比較 結(jié)果見圖2、表2。

圖2 各組大鼠海馬組織p-CREB和CREB蛋白表達條帶

表2 各組大鼠海馬組織p-CREB和CREB蛋白的表達（±s）

表2 各組大鼠海馬組織p-CREB和CREB蛋白的表達（±s）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組別空白組模型組中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組石杉堿甲組n 16 14 14 14 14 14 p-CREB蛋白表達0.849±0.172 0.334±0.038①0.771±0.133②0.596±0.082①②0.400±0.028①0.416±0.056①CREB蛋白表達0.886±0.143 0.195±0.024①0.834±0.162②0.619±0.015①②0.391±0.066①0.465±0.104①②

結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組p-CREB、CREB蛋白表達均明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，中藥高、中劑量組p-CREB、CREB 蛋白表達均明顯升高（P＜0.01），其中中藥高劑量組接近空白組水平（P＞0.05）；石杉堿甲組CREB 蛋白表達明顯升高，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.01）。

4 討 論

中醫(yī)對血管性癡呆沒有專門的論述，但是早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中已有關(guān)于癡呆癥狀的記載?！鹅`樞·天年》記載：“肺氣衰，魄離，故言善誤”，而“言善誤”正是癡呆病的重要癥狀，在此為肺氣虛，腦海失養(yǎng)所致?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論》記載：“血并于下，氣并于上，亂而喜忘?！睔庋啾緛硎窍嗷ソY(jié)合，協(xié)調(diào)運行的，故此血瘀積蓄于下，氣滯偏盛于上所致的“亂而喜忘”?！秱摗?37 條記載：“陽明證，其人喜忘者，必有蓄……宜抵當(dāng)湯下之。”“喜忘”屬于記憶力障礙，癡呆病的另一重要特征便是記憶障礙?？v觀血管性癡呆歷年以來的研究成果，在病因病機的認(rèn)識上，比較一致的看法是，其發(fā)病病位在腦，病機在臟腑氣，屬本虛標(biāo)實證。本虛為臟腑虧損，氣不足，尤與心肝脾腎虧虛關(guān)系密切；標(biāo)實為痰阻、血瘀、濁毒。在上世紀(jì)90 年代，我校唐農(nóng)教授提出了“腦病從肺論治”觀點，本研究的益肺宣肺降濁方是依據(jù)“從肺論治癡呆”的觀點擬定的經(jīng)驗方，前期臨床實踐已證實其具有良好的療效［5-8］。癡呆固然與五臟中心、肝、脾、腎虛損關(guān)系甚大，但肺臟虛損在其發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著重要的作用。如心主神志，為君主之官，但肺朝百脈，為相傅之官，輔佐心君；肝木失去肺金正常克制可致肝陽上亢；肺虛無法為脾宣發(fā)津液可致脾虛濕困；腎屬水主藏精，生髓，腦為髓海，而肺屬金主“收”，生腎水。癡呆病的特征是記憶的不同程度喪失，而記憶的喪失實際上是腎的“藏納”功能障礙，即收藏不利，直接影響到信息的存儲；而腎之“藏”是以肺之“收”為前提條件的，肺是啟動記憶存儲過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，標(biāo)實為瘀、痰濁、濁毒。“瘀痰”的發(fā)生是氣血津液運行失調(diào)的表現(xiàn)，“瘀”與肺的關(guān)系不待多言，肺朝百脈也?！疤禎帷眲t主要與肺、脾、腎三臟功能直接相關(guān)，而“濁毒”則與“腑滯”相關(guān)。肺與大腸相表里，二者協(xié)調(diào)配合，共同完成氣的宣降功能。老年人臟腑功能衰退，肺氣不足，宣降失職，大腸傳導(dǎo)失司，糟粕滯留腸腑，產(chǎn)生濁毒，清氣不升，濁陰不降，上擾清竅，從而導(dǎo)致癡呆發(fā)生。因此，肺臟虛損在癡呆發(fā)生發(fā)展過程中是一個不可忽視的環(huán)節(jié)，在治療癡呆這一疾病時，重視調(diào)理肺氣具有重要的臨床指導(dǎo)意義［9-13］。

石杉堿甲是從中藥材中提取出來的天然植物堿，作為一種可逆性膽堿酶抑制劑，其具有提高認(rèn)知功能、增強記憶保持和促進記憶再現(xiàn)的作用。本實驗選擇石杉堿甲作為陽性對照藥物，以更好地觀察益肺宣肺降濁方對血管性癡呆的治療作用。本實驗結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯，各中藥組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞壞死、凋亡較模型組顯著減輕，說明益肺宣肺降濁方對VD 大鼠海馬神經(jīng)元凋亡具有一定的保護和減緩作用，且中藥在一定的劑量范圍內(nèi)，隨著劑量的增加療效更顯著。

cAMP∕PKA-CREB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為學(xué)習(xí)、記憶障礙的一個重要信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在改善學(xué)習(xí)、記憶能力方面發(fā)揮著重要作用，其中，在cAMP∕PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，CREB 和p-CREB 蛋白的表達極其關(guān)鍵［14-16］，本實驗結(jié)果表明，血管性癡呆大鼠應(yīng)用益肺宣肺降濁方治療后，可增加海馬CA1 區(qū)p-CREB 和CREB 蛋白的表達，結(jié)合神經(jīng)元凋亡實驗結(jié)果，提示益肺宣肺降濁方可增強cAMP∕PKA-CREB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，可用于改善血管性癡呆患者的臨床癥狀。