李 慧，付玉娟，焦麗麗，劉淑瑩，宋鳳瑞，吳 巍

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春 130022)

甾體激素(steroid hormones)又稱類固醇激素，是一類四環(huán)脂肪烴化合物，在中樞或周圍神經(jīng)系統(tǒng)中合成，被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)記物，在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)性功能、促進(jìn)機(jī)體發(fā)育等方面具有重要作用[1-2]。甾體激素的含量極低，檢測響應(yīng)值低，直接檢測難度較大，對(duì)檢測手段的靈敏度要求較高，是醫(yī)療、環(huán)境、畜牧業(yè)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[3]。

甾體激素的檢測常采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)，該方法的靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)多種成分同時(shí)檢測[4-7]。GC/MS應(yīng)用于甾體激素檢測時(shí)常需要對(duì)酮基和羥基進(jìn)行衍生來提高樣品的揮發(fā)性，而酮基不含氫原子，是衍生反應(yīng)的難點(diǎn)。通常，酮基的衍生有烯醇化和肟化兩種方法，其中烯醇化的產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，應(yīng)用范圍有限[8-10]；肟化反應(yīng)是將酮基在一定條件下與羥胺類物質(zhì)進(jìn)行親核加成反應(yīng)，生成肟類物質(zhì)，產(chǎn)物穩(wěn)定性較好，同時(shí)N-的加成能夠提高樣品的信號(hào)強(qiáng)度。雖然肟化反應(yīng)應(yīng)用較早[11-12]，但是對(duì)甾體激素酮基肟化反應(yīng)的研究報(bào)道較少。甾體激素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同系物多，在衍生過程中易產(chǎn)生異構(gòu)化，衍生條件對(duì)衍生效果有較大影響[13]。因此，研究甾體激素的衍生過程具有重要意義。

本工作以12種內(nèi)源性甾體激素為研究對(duì)象，以甲氧胺(methoxyammonium chloride, MOX)和N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(N-methyl-N-trimethylsilyl trifluoroacetamide, MSTFA)為衍生化試劑，研究其肟化規(guī)律。通過GC/MS鑒定衍生物結(jié)構(gòu)，推測衍生反應(yīng)過程，考察衍生反應(yīng)條件，希望能夠建立一種甾體激素的GC/MS分析方法，為內(nèi)源性甾體激素的GC/MS分析提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TRACE1310氣相色譜儀，TSQ 8000三重四極桿質(zhì)譜儀：美國Thermo公司產(chǎn)品；MTN-2800D氮吹濃縮裝置：天津奧特賽斯儀器有限公司產(chǎn)品；SQP電子分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；H-2 BLENDER渦旋混合器：上海精勝儀器有限公司產(chǎn)品；HB120-S金屬?。荷虾Ｙ惒畼穬x器有限公司產(chǎn)品。

脫氫表雄酮(dehydroeppiandrosterone, DHEa)、雙氫睪酮(dihydrotestosterone, DHT)、雄酮(Androsterone, ADL)對(duì)照品：均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；表雄酮(epiandrosterone, Epian)、孕烯醇酮(pregnenolone, Preg)對(duì)照品：均為北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；睪酮(testosterone, T)、雌酮(estrone, E1)、雄烯二酮(androstenedione, ASD)對(duì)照品：均為德國Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司產(chǎn)品；皮質(zhì)甾酮(corticosterone, B)、可的松(cortisone, E)對(duì)照品：均為梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；孕酮(progesterone, P)對(duì)照品：由中國食品藥品檢定研究院提供；別孕烯醇酮(Allopregnanolone, AP)對(duì)照品：加拿大TRC公司產(chǎn)品。

二氯甲烷(色譜純)：美國J.T. Baker公司產(chǎn)品；甲氧胺鹽酸鹽：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺：北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純)：美國Tedia公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1色譜條件 色譜柱：Supelco SPBTM-5(15 m×0.53 mm×0.5 μm)；載氣為99.999%高純N2，流速1 mL/min；升溫程序：初始柱溫50 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，然后以5 ℃/min升至245 ℃，保持5 min，再以1.5 ℃/min升至248 ℃，保持1 min；進(jìn)樣方式及進(jìn)樣量：全掃描模式下分流比為20∶1，MRM檢測模式下不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件 EI離子源；MS傳輸管溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃。從5 min起檢測，采用全掃描(Full Scan)模式鑒定衍生物結(jié)構(gòu)，質(zhì)量掃描范圍m/z50～800，定量分析時(shí)采用單反應(yīng)離子檢測(selective reaction monitoring mode, SRM)模式。

1.2.3樣品的衍生化方法 采用肟化結(jié)合硅烷化處理甾體激素。精密稱定各1 mg 12種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用甲醇溶解后，精密量取100 μL，加入MOX的甲醇溶液，置于金屬浴中避光進(jìn)行肟化反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?。在肟化反?yīng)瓶中加入120 μL MSTFA，渦旋混合，置于70 ℃金屬浴中避光30 min進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，再次氮?dú)獯蹈?，加? mL二氯甲烷渦旋復(fù)溶，過濾后待檢測。

1.2.4衍生條件的優(yōu)化 為獲得最佳的衍生條件，本實(shí)驗(yàn)對(duì)肟化反應(yīng)過程中的衍生溫度、衍生化試劑用量和衍生時(shí)間等因素進(jìn)行了考察。

衍生溫度：取100 μL濃度均為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入50 μL 10 g/L的MOX甲醇溶液，分別在25、40、60、80、100 ℃下衍生30 min；氮?dú)獯蹈珊?，加?00 μL MSTFA，于70 ℃反應(yīng)30 min，再次氮?dú)獯蹈?，? mL二氯甲烷復(fù)溶，過濾，進(jìn)樣。

衍生化試劑用量：取100 μL濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入30、50、60、70、80 μL濃度為10 g/L的MOX甲醇溶液，使MOX與酮基的比例分別為：10∶1，16∶1，20∶1，23∶1和27∶1，在80 ℃下反應(yīng)30 min；氮?dú)獯蹈珊?，加?00 μL MSTFA，于70 ℃下反應(yīng)30 min，用二氯甲烷復(fù)溶，過濾，進(jìn)樣。

衍生時(shí)間：取100 μL 1 g/L的DHEA溶液，加入60 μL MOX溶液，于80 ℃下分別反應(yīng)30、40、50、60 min后，氮?dú)獯蹈?，再加?00 μL MSTFA，于70 ℃反應(yīng)30 min，再次氮?dú)獯蹈?，用二氯甲烷?fù)溶，過濾，進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 甾體激素衍生物的質(zhì)譜分析方法

肟化-硅烷化可以改變羥基和羰基的極性，提高樣品的揮發(fā)性。本實(shí)驗(yàn)通過肟化-硅烷化兩步反應(yīng)對(duì)甾體激素進(jìn)行衍生，肟化-硅烷化反應(yīng)的結(jié)構(gòu)通式示于圖1。

圖1 甾體激素衍生反應(yīng)結(jié)構(gòu)通式Fig.1 Reaction formula of Steroids with MOX and MSTFA

2.2 甾體激素衍生物的質(zhì)譜分析

采用1.2.2節(jié)方法對(duì)12種甾體激素進(jìn)行衍生反應(yīng)，得到甾體激素衍生產(chǎn)物的色譜圖和質(zhì)譜圖，示于圖3。Preg(圖3a)、DHEA(圖3b)、AP(圖3c)、ADL(圖3d)、DHT(圖3e)和Epian(圖3f)的總離子流色譜圖中均只出現(xiàn)一個(gè)色譜峰，基線平整、峰形較好、待測物響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)， 表明上述6種化合物經(jīng)衍生后均得到一種衍生產(chǎn)物。6種甾體激素中均存在羥基和酮基結(jié)構(gòu)，在質(zhì)譜圖中均檢測到[M+29+72]+質(zhì)譜峰，表明衍生產(chǎn)物為羥基和酮基分別發(fā)生肟化和硅烷化。同樣，在質(zhì)譜圖中觀測到[M-15]+、[M-31]+、[M-73]+、[M-90]+的質(zhì)譜峰，分別為肟化后和硅烷化后的特征峰，進(jìn)一步確定其為肟化和硅烷化的產(chǎn)物。因此，上述6種甾體激素的酮基和羥基均發(fā)生衍生反應(yīng)，衍生效果較好。

圖2 Epian衍生產(chǎn)物(MO-TMS-Epian)的碎片離子及質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Fragment ions and fragmentation pathways of derived Epian (MO-TMS-Epian)

注：a.Preg;b.DHEA;c.AP;d.ADL;e.DHT;f.Epian；g.P；h.ASD；i.T圖3 甾體激素衍生物的總離子流圖和碎片離子峰Fig.3 Total ion chromatograms and fragment ions of steroid hormone derivatives

P(圖3g)、ASD(圖3h)、T(圖3i)甾體激素的總離子流色譜圖中出現(xiàn)2個(gè)色譜峰。在質(zhì)譜圖中同樣觀測到[M-15]+、[M-31]+、[M-73]+、[M-90]+的碎片離子峰，表明它們也發(fā)生了肟化和硅烷化反應(yīng)，分別生成biMO-P、biMO-ASD、MO-TMS-T。三種化合物產(chǎn)生的衍生產(chǎn)物的碎片離子峰相同，它們各自的衍生產(chǎn)物為同分異構(gòu)體。通過對(duì)比這3種甾體激素發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)中均存在共軛雙鍵，該類化合物在與氮親核試劑發(fā)生加成反應(yīng)時(shí)，酮基中的π電子被拉向氧原子，酮基中的碳是缺電子中心，親核試劑從空間阻礙小的酮基平面上面或下面進(jìn)攻碳原子，與酮基加成生成產(chǎn)物[5]，脫水后形成含有碳氮雙鍵的肟化產(chǎn)物。氮與酮基的碳生成碳氮雙鍵會(huì)影響幾何異構(gòu)的現(xiàn)象，形成順反異構(gòu)體，所以在總離子流色譜圖中出現(xiàn)雙峰，同時(shí)總離子流色譜圖中基線噪音較大，待測物信號(hào)較弱。

除上述9種甾體激素外，還有3種甾體E、B和E1相對(duì)復(fù)雜。E結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)酮基，2個(gè)羥基，結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，理論上可以分別發(fā)生肟化和硅烷化反應(yīng)，同時(shí)酮基與苯環(huán)上的雙鍵形成共軛結(jié)構(gòu)。在E衍生產(chǎn)物的總離子流圖中檢測到6種衍生產(chǎn)物，示于圖4。色譜峰a和b的質(zhì)譜峰碎片相同，為同分異構(gòu)體(圖4a和圖4b)。圖4a中檢測到了連續(xù)失去碎片 —OCH3的m/z560、529、498和m/z470、439、408、377碎片離子，表明衍生結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)肟化基團(tuán)，即3個(gè)酮基均被衍生，即tR為40.92 min的這對(duì)同分異構(gòu)體是E中3個(gè)酮基和2個(gè)羥基完全衍生后的產(chǎn)物triMO-biTMS-E。衍生后其分子質(zhì)量為591 u，但在總離子流圖中并未檢測到m/z591質(zhì)譜峰，表明衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，發(fā)生了裂解。tR為42.06、42.14 min的2個(gè)衍生產(chǎn)物具有相同的碎片離子，在質(zhì)譜圖中均檢測到m/z562質(zhì)譜峰，表明二者是同分異構(gòu)體，示于圖4c，4d。m/z531是衍生產(chǎn)物失去一個(gè)—OCH3基團(tuán)產(chǎn)生的碎片，同時(shí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)m/z441、351質(zhì)譜峰，表明其中含有2個(gè)硅烷化基團(tuán)。結(jié)合E的結(jié)構(gòu)，推測tR為42.06、42.14 min的2個(gè)衍生產(chǎn)物為2個(gè)酮基和2個(gè)羥基發(fā)生衍生后的產(chǎn)物biMO-biTMS-E，而由于空間位阻的存在，推測其發(fā)生肟化反應(yīng)部位為C3和C11位連接的酮基。tR為43.14、43.39 min的化合物是一對(duì)同分異構(gòu)體(圖4e和圖4f)，其母離子為m/z490.13，在質(zhì)譜圖中檢測到m/z459、428、399質(zhì)譜峰，證實(shí)了衍生產(chǎn)物biMO-TMS-E是2個(gè)酮基和1個(gè)羥基分別發(fā)生肟化和硅烷化反應(yīng)得到的。同樣，由于受空間位阻的影響，推測衍生產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式示于圖4e、4f。

注：a.triMO-biTMS-E;b.triMO-biTMS-E;c.biMO-biTMS-E;d.biMO-biTMS-E;e.biMO-TMS-E；f.biMO-TMS-E圖4 甾體激素E衍生物的總離子流圖和碎片離子峰Fig.4 Total ion chromatograms and fragment ions of steroid bormone E derivatives

B結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)酮基、2個(gè)羥基，酮基與苯環(huán)存在共軛結(jié)構(gòu)，共檢測到6種衍生產(chǎn)物，標(biāo)記為a～f，示于圖5。B結(jié)構(gòu)中存在共軛結(jié)構(gòu)，且質(zhì)譜圖5a、5b、5c、5d中母離子均為m/z548，比原分子質(zhì)量增加了202 u，表明衍生產(chǎn)物均為biTMS-biMO-B，這4種化合物為同分異構(gòu)體(tR分別為42.17、42.32、43.07、43.18 min)。圖5e和圖5f中分子離子峰為519 u，表明tR為43.37、43.62 min的化合物為MO-biTMS-B。

E1結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)酚羥基及1個(gè)酮基，可以分別發(fā)生肟化和硅烷化反應(yīng)，在E1的衍生產(chǎn)物總離子流色譜圖中出現(xiàn)2個(gè)色譜峰，示于圖6，其中圖6a中母離子m/z371比衍生前的分子質(zhì)量增加101 u，同時(shí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)[M-31]+、[M-72]+峰，表明圖6a為肟化-硅烷化E1，即MO-TMS-E1。圖6b中母離子m/z299(tR為26.01 min)比衍生前的分子質(zhì)量增加 29 u，同時(shí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)[M-31]+峰，表明圖6b為肟化產(chǎn)物MO-E1，二者提取離子流峰面積比值為0.69∶1，表明E1結(jié)構(gòu)中的酮基由于受到苯環(huán)的吸電子作用，不易發(fā)生硅烷化反應(yīng)。

注：a.biMO-biTMS-B；b.biMO-biTMS-B；c.biMO-biTMS-B；d.biMO-biTMS-B；e.MO-biTMS-B；f.MO-biTMS-B圖5 甾體激素B衍生物的總離子流圖和碎片離子峰Fig.5 Total ion chromatograms and fragment ions of steroid hormone B derivatives

注：a.MO-TMS-E1;b.MO-E1圖6 甾體激素E1衍生物的總離子流圖和碎片離子峰Fig.6 Total ion chromatograms and fragment ions of E1 steroid hormone derivatives

甾體激素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，衍生反應(yīng)后產(chǎn)物較多，衍生產(chǎn)物的總離子流圖中均未能檢測到原型化合物。通過對(duì)衍生產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，所有硅烷化產(chǎn)物均生成m/z73碎片離子，該離子是三甲基硅烷衍生化后丟失的典型碎片—Si(CH3)3，可以作為硅烷化衍生產(chǎn)物的鑒定依據(jù)，同時(shí)出現(xiàn)[M-91]+峰。衍生產(chǎn)物質(zhì)譜圖中產(chǎn)生[M-31]+碎片離子，是丟失1個(gè)甲氧基產(chǎn)生的。在肟化-硅烷化產(chǎn)物中產(chǎn)生的m/z73碎片離子及[M-31]+碎片離子可以作為甾體激素肟化-硅烷化后衍生產(chǎn)物的鑒定依據(jù)。

2.3 衍生條件的考察

為獲得最佳的衍生條件，以DHEA為例，對(duì)衍生過程中關(guān)鍵的肟化反應(yīng)衍生溫度、反應(yīng)時(shí)間、衍生化試劑用量進(jìn)行了考察。以不同條件下的提取離子流峰面積為縱坐標(biāo)，衍生條件為橫坐標(biāo)，得到的MO-TMS-DHEA關(guān)系曲線示于圖7。

在一定范圍內(nèi)，MO-TMS-DHEA的峰面積隨著MOX含量的增加而逐漸增加，持續(xù)增加MOX含量超過一定值后，會(huì)使峰面積下降，示于圖7a。表明增加MOX含量能夠提高衍生效率，但過量的MOX不利于反應(yīng)進(jìn)行，需根據(jù)底物和衍生化試劑的用量換算，即酮基與衍生化試劑甲氧胺的比例在1∶20時(shí)的衍生反應(yīng)效率最高。隨著衍生時(shí)間的增長，衍生產(chǎn)物含量會(huì)發(fā)生變化，反應(yīng)時(shí)間在40 min時(shí)達(dá)到最大值，進(jìn)一步延長反應(yīng)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致衍生物降解，示于圖7b。在低溫條件下，衍生效果不佳，MO-TMS-DHEA的峰面積隨著溫度升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)，峰面積達(dá)到最大值，繼續(xù)升高溫度，峰面積值下降，這可能是溫度過高導(dǎo)致了衍生物降解，示于圖7c。因此，對(duì)于甾體激素中酮基肟化衍生化反應(yīng)，最佳條件為80 ℃反應(yīng)40 min，且酮基與MOX的摩爾比為1∶20。

2.4 甾體激素的線性范圍考察

在最佳衍生條件下，對(duì)12種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的線性關(guān)系進(jìn)行初步考察。分別精密稱定各1 mg對(duì)照品，稀釋成濃度為10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.3節(jié)進(jìn)行衍生，采用SRM掃描方式，以峰面積為指標(biāo)優(yōu)化掃描模式，得到衍生物的掃描離子對(duì)，結(jié)果列于表1。

注：a.衍生試劑體積；b.衍生時(shí)間；c.衍生溫度圖7 衍生條件對(duì)衍生產(chǎn)物生成量的影響Fig.7 Effect of conditions on the amount of derivatives

序號(hào)No.化合物Compounds分子式Molecular formula分子量MW離子對(duì)Ion pair(m/z)碰撞能量Collision energy/eV1DHEAC19H28O2288.21358/26882PregC21H32O2316.24386/31283APC21H34O2318.26419/32964ADLC19H30O2290.22391/27065EpianC19H30O2290.22391/27086DHTC19H30O2290.22391/27087PC21H30O2314.22372/28668EC21H28O5360.19441/282109TC19H28O2288.21389/269810E1C18H22O2270.16299/268611ASDC19H26O2286.19344/329612BC21H30O2346.21548/3616

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到含有異構(gòu)體的6種衍生后化合物triMO-triTMS-E、MO-TMS-T、MO-TMS-E1、MO-TMS-ASD、MO-TMS-P、biMO-biTMS-B的線性范圍為5～200 μg/L，而MO-TMS-DHEA、MO-TMS-Preg、MO-TMS-AP、MO-TMS-DHT、MO-TMS-ADL和MO-TMS-Epian的線性范圍為1～200 μg/L。表明上述12種衍生后甾體化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，在該反應(yīng)條件下的最低檢測限為1 μg/L。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用肟化-硅烷化方法研究了12種內(nèi)源性甾體激素酮基衍生反應(yīng)，結(jié)合GC/MS法分析衍生產(chǎn)物，系統(tǒng)研究了甾體激素酮基衍生規(guī)律。結(jié)果表明，肟化-硅烷化后可以顯著提高待測物的靈敏度，C3位含有羥基且C17(C20)位含有酮基的甾體激素(DHEA, Preg, AP, ADL, Epian, DHT)發(fā)生的肟化-硅烷化反應(yīng)完全，生成物的質(zhì)譜響應(yīng)高，雜質(zhì)生成量少，檢測靈敏度可以達(dá)到1 μg/L，這類甾體化合物采用GC/MS結(jié)合柱前衍生分析的效果較好。當(dāng)甾體激素中存在共軛結(jié)構(gòu)時(shí)易產(chǎn)生順反異構(gòu)體，產(chǎn)物復(fù)雜。通過優(yōu)化肟化反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)與甾體激素反應(yīng)的最佳條件是80 ℃反應(yīng)40 min，酮基與MOX的摩爾比為1∶20。該方法檢測甾體激素的靈敏度可達(dá)ng級(jí)，SRM掃描模式下的線性范圍可達(dá)1～200 μg/L，可為相關(guān)激素類成分的分析提供檢測技術(shù)支持。