辛?xí)栽?王 斌，2 趙岫云 張德雙 汪維紅 余陽俊 蘇同兵 于拴倉 張鳳蘭*

（1 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097；2 北京市農(nóng)學(xué)院植物與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

大白菜原產(chǎn)我國，是種植面積最大的蔬菜作物。先期抽薹嚴(yán)重影響了大白菜的產(chǎn)量和質(zhì)量，是育種中亟待解決的問題。植物開花的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種調(diào)節(jié)途徑。對于二年生的大白菜來說，春化作用是成花所必需的，因此研究春化途徑對解析大白菜的開花調(diào)控機(jī)理具有重要的意義。

VERNALIZATION INSENSITIVE 3（VIN3）屬于PHD-finger 蛋白，是春化途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在擬南芥上的研究表明，VIN3在春化過程中與VERNALIZATION 1（VRN1）、VERNALIZATION 2（VRN2）以 及Polycomb Repression Complex 2（PRC2）一起形成復(fù)合體作用于FLC組蛋白染色質(zhì)，使其組蛋白H3第27位賴氨酸發(fā)生三甲基化修飾（H3K27 me3），從而抑制FLC的表達(dá)以促進(jìn)植物開花（Ruth et al.，2004；Sibum &Richard，2004；Kim &Sung，2017）。VIN3蛋白在白菜等十字花科蔬菜的春化途徑中也發(fā)揮著同樣重要的作用（胡功鈴 等，2010；于錫宏 等，2012；Su et al.，2018）。Su 等（2018）研究表明，在春白菜選育過程中，BrVIN3.1和BrFLC1基因同時(shí)受到選擇，BrVIN3.1通過調(diào)節(jié)BrFLC1的表達(dá)參與春化誘導(dǎo)白菜開花途徑的調(diào)控。BrVIN3.1和BrFLC1作為同一條遺傳通路的兩個(gè)重要因子被組合選擇，它們在由春化誘導(dǎo)白菜開花途徑中行使主要功能。

ZINC FINGER OF ARABIDOPSIS THALIANA 12（ZAT12）為典型的C2H2型鋅指蛋白（黃驥和張紅生，2007），是一個(gè)參與ROS 相關(guān)抗氧化系統(tǒng)活化的非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠在幾分鐘內(nèi)響應(yīng)干旱、高溫、高光強(qiáng)、高鹽度以及機(jī)械傷害、過氧化氫（H2O2）、甲基紫精（百草枯）、環(huán)己酰亞胺處理等多種脅迫（Vogel et al.，2004；Davletova et al.，2005；Ben Daniel et al.，2016）。在擬南芥中，ZAT12在活性氧和非生物脅迫信號中發(fā)揮核心作用（Davletova et al.，2005）。筆者在擬南芥eFP Browser（http：//bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）中觀察到，ZAT12在花器官中有著較高的表達(dá)，暗示ZAT12在花器官中發(fā)揮作用，但是關(guān)于ZAT12影響植物開花，特別是影響大白菜等十字花科蔬菜抽薹的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)通過酵母文庫篩選和酵母雙雜交驗(yàn)證尋找BrVIN3.1互作蛋白，進(jìn)而分析不同花期大白菜中候選基因的表達(dá)模式，挖掘春化誘導(dǎo)開花途徑中的其他調(diào)節(jié)因子，旨在為進(jìn)一步深入解析大白菜開花調(diào)控分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試大白菜品種分別為白楊，不耐抽薹；膠二葉，耐抽薹，均來源于北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心白菜課題組。種子經(jīng)催芽萌發(fā)后種植到營養(yǎng)土中，正常溫度（22 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗）生長21 d，然后轉(zhuǎn)移至低溫（4 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗）春化處理21 d，處理結(jié)束后再在正常溫度條件下生長7 d。自春化處理開始，每隔7 d 分別收取白楊和膠二葉葉片樣品1次。

1.2 菌株、載體和主要試劑

克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1（CD501-03）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（BC304-01）購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；pGADT7、pGBDT7等相關(guān)載體為北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心葉根菜類蔬菜遺傳與育種研究室保存；SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒（B518131-0100）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒（離心柱型）（Cat，#DP103-03）、RNA Prep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（離心柱型）（Cat，#DP441）購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript TM reagent Kit with gDNA Eraser 購自大連寶生物工程有限公司；載體克隆試劑 盒ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit（C112）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒LightCycler 480 SYBR GreenⅠMaster（04887352001）購自上海羅氏制藥有限公司；其余試驗(yàn)試劑購自北京化工廠。引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成，DNA 序列一代測序由北京擎科技術(shù)有限公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)及目的基因克隆

利用BRAD 數(shù)據(jù)庫（http：//brassicadb.org/brad/）以及載體多克隆位點(diǎn)序列，并結(jié)合DNAMAN 設(shè)計(jì)BrVIN3.1和BrZAT12的特異性引物，相關(guān)引物序列詳見表1。

表1 試驗(yàn)所需相關(guān)引物序列

采用植物總RNA 提取試劑盒提取大白菜白楊樣品葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，-80 ℃保存。

以上述獲得的cDNA 為模板，進(jìn)行高保真PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用回收試劑盒回收目的片段。

1.4 相關(guān)載體的構(gòu)建

將回收的目的片段按照載體克隆試劑盒說明書所述方法，與pGADT7和pGBKT7載體連接，構(gòu)建策略如圖1所示，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，菌懸液分別涂布于含氨芐青霉素（Amp）和卡那霉素（Kan）的LB 平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上多個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，確認(rèn)序列無誤后，利用質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒pGBKT7-BrVIN3.1、pGBKT7-BrZAT12待用。

圖1 載體構(gòu)建策略

1.5 酵母雙雜交試驗(yàn)

參照Chang 等（2017）的方法，將重組質(zhì)粒pGBKT7-BrVIN3.1、pGBKT7-BrZAT12轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。

酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備：挑取在YPDA 固體培養(yǎng)基上生長的酵母AH109，接入200 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6；室溫條件下5 000 g 離心5 min，收集菌體，3 mL 無菌水重懸；室溫條件下5 000 g 再離心5 min，棄上清液，菌體使用1 mL TE/LiAc 緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 值7.5，1 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1LiAc）重懸，即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞：將上述酵母感受態(tài)細(xì)胞分裝為每管50 μL，加入10 μL 鮭精DNA、pGADT7載體和pGBKT7載體質(zhì)粒各0.5 μL，最后 加 入300 μL PEG/LiAC 緩 沖 液（10 mmol·L-1Tris-HCl，pH 值7.5，1 mmol·L-1EDTA，5%PEG4000），充分混勻后28 ℃、220 r·min-1振蕩30 min；加入終濃度為10%的DMSO，混勻后42℃水浴15 min，立即冰浴2 min；6 000 g 離心3 min，收集菌體，使用200 μL TE 緩沖液（10 mmol ·L-1Tris-HCl，pH 值7.5，1 mmol·L-1EDTA）重懸，均勻地涂布在2D 培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～4 d；待長出菌斑后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA 培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～4 d。

顯色：將生長在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA培養(yǎng)基上的新鮮菌斑轉(zhuǎn)印到濾紙上，液氮冷凍10 s，室溫自然融化；重復(fù)冷凍融化2次。將粘有菌斑的濾紙浸泡在顯色溶液（2 mL Z buffer，5.4 μL β-mercaptoethanol，33.4 μL X-gal）中，30 ℃避光顯色8 h，染為藍(lán)色的菌斑即認(rèn)為有相互作用，不被染色的菌斑則認(rèn)為沒有相互作用。

Z buffer 配 方：Na2HPO4· 7H2O 16.7 g·L-1，NaH2PO4· H2O 5.50 g·L-1，KCl 0.57 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.246 g·L-1，調(diào)節(jié)pH 值為7.0。

X-gal 配方：用二甲基甲酰胺（DMF）將5-溴-6-氯-3-β-D-半乳糖苷（X-gal）溶解為20 mg·mL-1。

1.6 熒光定量PCR 分析

利用植物總RNA 提取試劑盒提取1.1中收取的白楊和膠二葉的葉片樣品總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并將cDNA 稀釋至200 ng·μL-1待用。利用BRAD 數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)適用于熒光定量PCR 的引物，采用試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BrZAT12與BrVIN3.1的互作分析

已有研究表明，BrVIN3.1是春化途徑中的重要調(diào)節(jié)基因（Su et al.，2018），為了進(jìn)一步解析春化途徑的分子機(jī)制，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心葉根菜類蔬菜遺傳與育種研究室前期構(gòu)建了大白菜cDNA 酵母文庫，以BrVIN3.1（Bra020445）為誘餌，篩選互作蛋白。對篩選到的互作蛋白進(jìn)行注釋發(fā)現(xiàn)，其中包括BrZAT12（Bra006691）。為了驗(yàn)證BrVIN3.1與BrZAT12的互作關(guān)系，本試驗(yàn)進(jìn)一進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，除pGADT7-BrZAT12和pGBKT7-BrVIN3.1能 在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/AbA 篩選平板上生長且顯色后變藍(lán)外，其他組合均不能正常生長變藍(lán)，證明BrVIN3.1能夠與BrZAT12互作，表明BrZAT12可能參與了BrVIN3.1介導(dǎo)的大白菜春化開花途徑。

圖2 BrVIN3.1與BrZAT12蛋白互作的酵母雙雜一對一驗(yàn)證

2.2 BrZAT12蛋白的氨基酸序列比對

BrZAT12作為BrVIN3.1的互作蛋白，其生物學(xué)功能目前尚沒有明確的報(bào)道。為了預(yù)測BrZAT12的生物學(xué)功能，本試驗(yàn)利用大白菜克隆得到的BrZAT12氨基酸序列，通過Blastn 程序在NCBI 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索相似氨基酸序列，利用鄰位相連法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖3-a 所示，植物中的ZAT12蛋白進(jìn)化主要有3個(gè)分支，大白菜（Brassica rapa）的BrZAT12與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、丹參（Eutrema salsugineum）、薺 藍(lán)（Camelina sativa）的ZAT12同處于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近。進(jìn)一步利用DNAMAN 軟件對大白菜與擬南芥的ZAT12氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，兩者的同源性高達(dá)84.66%（圖3-b），由此證明大白菜BrZAT12與擬南芥的ZAT12為同源基因，具有較近的親緣關(guān)系?，F(xiàn)有的研究顯示擬南芥ZAT12作為轉(zhuǎn)錄因子廣泛地參與了包括低溫在內(nèi)的非生物脅迫的響應(yīng)，并且在花器官中表達(dá)升高。春化誘導(dǎo)的植物抽薹開花是在低溫逆境的基礎(chǔ)上發(fā)生的，由此推測BrZAT12也參與了大白菜開花調(diào)節(jié)途徑。

2.3 春化處理中BrZAT12 與BrVIN3.1 的表達(dá)模式分析

圖3 大白菜BrZAT12與AtZAT12同源性比較

圖4 春化處理中BrVIN3.1 與BrZAT12 的表達(dá)模式分析

為了探究BrZAT12在春化開花途徑中與BrVIN3.1的上下游關(guān)系，本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測低溫處理后BrVIN3.1和BrZAT12的表達(dá)量。選取易抽薹的白楊和耐抽薹的膠二葉作為試驗(yàn)材料，跟蹤檢測春化處理中BrVIN3.1和BrZAT12的表達(dá)量。由圖4可知，持續(xù)低溫處理能夠誘導(dǎo)BrVIN3.1的表達(dá)，低溫處理結(jié)束后又恢復(fù)到正常水平，并且易抽薹材料白楊的上調(diào)幅度明顯高于耐抽薹材料膠二葉，證明BrVIN3.1在春化途徑中促進(jìn)開花，這一結(jié)果與之前的報(bào)道（Su et al.，2018）一致。同時(shí)低溫處理后BrZAT12的表達(dá)量開始顯著上升，在低溫處理14 d 時(shí)達(dá)到峰值，低溫處理結(jié)束后又迅速回落，并且易抽薹材料白楊中BrZAT12的表達(dá)量明顯高于耐抽薹材料膠二葉。該結(jié)果表明BrZAT12能夠迅速響應(yīng)春化處理，同時(shí)BrZAT12受低溫誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間要早于BrVIN3.1，BrZAT12在低溫處理14 d 后表達(dá)量上升幅度最快并達(dá)到表達(dá)最高峰，而BrVIN3.1的表達(dá)則要滯后7 d，在低溫處理21 d 后達(dá)到表達(dá)最高峰，這表明BrZAT12在遺傳關(guān)系上可能位于BrVIN3.1的上游。

3 結(jié)論與討論

BrVIN3.1作為大白菜春化途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)量特異地受到春化處理的誘導(dǎo)，但是目前春化處理誘導(dǎo)BrVIN3.1的表達(dá)機(jī)制尚沒有解析清楚。本試驗(yàn)利用酵母文庫篩選和酵母雙雜交驗(yàn)證，BrVIN3.1與BrZAT12在體內(nèi)相互作用，這表明BrZAT12蛋白可能在大白菜抽薹開花中發(fā)揮著一定的作用。熒光定量PCR 結(jié)果表明，BrZAT12確實(shí)受低溫誘導(dǎo)，并且影響了開花基因BrVIN3.1的表達(dá)，但是BrZAT12受低溫誘導(dǎo)的方式和BrVIN3.1受低溫誘導(dǎo)的方式存在差異，BrVIN3.1的誘導(dǎo)表達(dá)滯后于BrZAT12，擬南芥中VIN3和ZAT12低溫處理后的表達(dá)模式也存在類似差異（Vogel et al.，2004；Franziska &George，2011），推測BrZAT12可能作為BrVIN3.1的一個(gè)上游作用因子，在大白菜開花中發(fā)揮影響。

在擬南芥中，過表達(dá)ZAT12蛋白可導(dǎo)致植物形態(tài)發(fā)育的多種表型。Rizhsky 等（2004）報(bào)道，ZAT12過表達(dá)對植物生長和發(fā)育沒有影響；而Iida等（2000）認(rèn)為，ZAT12過表達(dá)植株在葉形和葉色上與對照相比存在差異。Vogel 等（2004）認(rèn)為ZAT12過表達(dá)強(qiáng)烈影響植物生長發(fā)育，例如卷片、短葉柄、長角果等表型。前人研究得到不同結(jié)論的原因，可能是由于不同研究中獲得的過表達(dá)植株ZAT12表達(dá)水平存在差異導(dǎo)致的。Vogel 等（2004）研究表明，6周齡野生型（WT）和ZAT12過表達(dá)（35S∶∶ZAT12）植物在生長上存在著明顯的差異，ZAT12過表達(dá)（35S∶∶ZAT12）表現(xiàn)出了類似的晚花表型。但是，對于BrZAT12對開花途徑的影響和功能的研究，還應(yīng)該多增加一些遺傳方面的證據(jù)。比如構(gòu)建過表達(dá)BrZAT12的大白菜或擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，利用Crispr/cas9基因編輯技術(shù)敲除大白菜BrZAT12基因，觀察它們的表型和開花相關(guān)指標(biāo)等。

綜上，推測BrZAT12蛋白可能作為BrVIN3.1的一個(gè)上游調(diào)控因子，在大白菜抽薹開花中發(fā)揮作用，這也將為白菜類蔬菜品種選育以及分子育種等研究提供理論依據(jù)。