白銳琴 張正海 曹亞從 于海龍 朱硯姝 劉 婧 張南南 王立浩 張寶璽

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

韃靼內(nèi)絲白粉菌（Leveillula taurica）是一種專性寄生植物的病原菌，寄主范圍廣泛，由此類真菌引發(fā)的白粉病在世界各地均有發(fā)生，危害多種經(jīng)濟(jì)作物（Palti，1971；Siahaan et al.，2016），包括辣椒、茄子、番茄（Palti，1988；Soo et al.，1995；Bubici &Cirulli，2008）、馬鈴薯（Marshi &Mathur，1980）、酸漿（Lucero et al.，2005）等茄果類作物。

20世紀(jì)90年代以來(lái)，辣椒白粉病在設(shè)施和露地栽培條件下普遍發(fā)生（Velasquez-Valle &Valle-Garcia，1999；de Souza &Café-Filho，2003；王萱 等，2007；Sudha &Lakshmanan，2009；Cerkauskas et al.，2011）。目前白粉病幾乎在所有辣椒種植地區(qū)均有發(fā)生，已成為一種世界性辣椒病害。Leveillula taurica主要為害辣椒葉片，其分生孢子由氣孔進(jìn)入辣椒葉片，在葉片內(nèi)萌發(fā)并在葉背面出現(xiàn)白色粉狀物，只有少數(shù)對(duì)白粉病敏感的品種在葉面顯現(xiàn)白粉病斑。隨著病情的發(fā)展，葉片發(fā)黃、脫落，影響光合作用，從而導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)和品質(zhì)降低。研究表明，不同基因型辣椒對(duì)白粉病的抗性差異明顯（Ullasa et al.，1981），為選擇和創(chuàng)制抗病育種材料提供了基礎(chǔ)，同時(shí)，選育抗病品種也是提高品質(zhì)、產(chǎn)量和減少農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染的重要途徑。

目前，已在辣椒栽培種一年生辣椒（Capsicum annuum）、灌木辣椒（C.frutescens）、下垂辣椒（C.baccatum）和中國(guó)辣椒（C.chinense）中發(fā)現(xiàn)了對(duì)白粉病具不同抗性的材料（Ullasa et al.，1981；Daubeze et al.，1989，1995；Blat et al.，2005，2006；Jo et al.，2017）。然 而，de Souza 和Café-Filho（2003）的研究認(rèn)為，大多數(shù)C.annuum是中感或高感白粉病的，辣椒白粉病的抗性資源主要存在于C.baccatum、C.chinense和C.frutescens3個(gè)栽培種中。

Lefebvre 等（2003）在田間自然發(fā)病和人工接種條件下，分別進(jìn)行辣椒白粉病抗性QTL 定位。將抗病材料H3抗性基因定位于2、5、6、9、10、12號(hào)染色體上，其中田間自然發(fā)病條件下僅檢測(cè)到6、9號(hào)染色體QTL 位點(diǎn)。Jo 等（2017）通過(guò)以VK515R 為抗病親本構(gòu)建的遺傳群體的定位分析，將白粉病抗病位點(diǎn)PMR1定位于辣椒4號(hào)染色體標(biāo)記CZ2_11628和HRM4.1.6之間的4 Mb 區(qū)域內(nèi)。Gabor 等（2017）報(bào)道抗病材料PBC167的白粉病抗性QTL 位于辣椒4號(hào)染色體上，在標(biāo)記NE0235653和NE0240958之間，遺傳距離小于40 cM。

本試驗(yàn)以辣椒抗白粉病材料H3和感病材料83-60構(gòu)建的重組自交系群體為研究對(duì)象，應(yīng)用KASPar 技術(shù)開(kāi)發(fā)SNP 分子標(biāo)記，對(duì)白粉病抗性基因進(jìn)行QTL 定位分析，探尋辣椒白粉病抗病機(jī)理，以期為辣椒抗白粉病分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用辣椒白粉病抗病材料H3（C.annuum）引自法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，感病材料83-60（C.annuum）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒課題組提供。利用H3、83-60及其雜交F1篩選多態(tài)性標(biāo)記；RIL（H3×83-60）F8群體142個(gè)重組自交系進(jìn)行白粉病抗性QTL 定位。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 辣椒白粉病抗性鑒定 分別于2016、2017年5月中旬，在山西忻州地區(qū)大棚和露地定植H3、83-60、F1及其RIL 群體的142個(gè)重組自交系，進(jìn)行白粉病抗性鑒定。每個(gè)重組自交系3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株，整個(gè)生長(zhǎng)期采用常規(guī)管理，自然發(fā)病。分別于2016年8月28日和9月11日、2017年9月20日和10月7日進(jìn)行表型調(diào)查。供試材料田間感病情況隨生長(zhǎng)期延長(zhǎng)而加重，表型數(shù)據(jù)均采用最后一次的調(diào)查結(jié)果。

白粉病病情評(píng)價(jià)指標(biāo)及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Daubeze等（1995）的方法并略有改動(dòng)。由3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)決定：感病葉片上菌落密度（Sp），感病葉片占全株的比例（Pr），及兩個(gè)指數(shù)相加得到的綜合感病度（DI）：DI=Sp+Pr。Sp、Pr 各分為0～5級(jí)，DI 為0～10級(jí)（表1）。

對(duì)兩年的病情指數(shù)（分別表示為Sp16、Pr16、DI16、Sp17、Pr17、DI17）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制RIL（H3×83-60）F8群體白粉病病情頻數(shù)分布圖，選用國(guó)際通用的SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)系數(shù)和方差分析（ANOVA）。

表1 辣椒白粉病病情評(píng)價(jià)指標(biāo)及分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 SNP 分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和遺傳圖譜構(gòu)建 按照CTAB 法（Doyle &Doyle，1987）提取雙親及F1的DNA，用于篩選及檢驗(yàn)多態(tài)性的分子標(biāo)記。提取RIL（H3×83-60）F8群體的DNA，用于基因型分析、遺傳圖譜構(gòu)建。

KASPar 反應(yīng)總體積4.055 μL，包括模板DNA（5 ng·μL-1）2 μL，引物預(yù)混液（FAM-labeled、HEX-labeled 和Common）0.055 μL，Master Mix 2 μL（LGC 有限公司，上海）。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性15 min；94 ℃變性20 s，61 ℃，1 min，10個(gè)循環(huán)（每個(gè)循環(huán)降低0.6 ℃）；94 ℃，20 s，55 ℃，1 min，26個(gè)循環(huán)；94 ℃，20 s，57 ℃，1 min，9個(gè)循環(huán)。

KASPar 結(jié)果統(tǒng)計(jì)：群體中基因型若與抗病親本H3熒光分型相同記為“a”，與感病親本83-60熒光分型相同記為“b”，與F1熒光分型相同記為“h”，未能識(shí)別的熒光分型記為“-”。

對(duì)獲得的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)據(jù)，利用JoinMap 4.0軟件，在LOD ≥3、步長(zhǎng)0.5的參數(shù)條件下，構(gòu)建遺傳連鎖圖。

1.2.3 QTL 定位 采用作圖軟件MAPQTL 6.0區(qū)間作圖法（interval mapping，IM）進(jìn)行QTL 分析，以LOD 值2.5為閾值，以LOD 最高值作為QTL位點(diǎn)，同時(shí)分析QTL 的加性效應(yīng)及表型變異的貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒白粉病抗性鑒定結(jié)果

兩年不同栽培環(huán)境重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明：抗病親本H3的感病葉片上菌落密度（Sp）、感病葉片占全株的比例（Pr）、綜合感病度（DI）平均值均顯著低于感病親本83-60（表2）。RIL（H3×83-60）F8群體2016、2017年的Sp 平均值分別為2.76、2.72，Pr 平均值分別為3.17、3.27，DI 平均值分別為5.90、6.09（表3）。比較親本和RIL 群體的白粉病抗性指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)群體中單株存在超親現(xiàn)象，出現(xiàn)了抗病表現(xiàn)優(yōu)于抗病親本H3的單株和感病程度高于感病親本83-60的單株。RIL 群體白粉病抗性指標(biāo)頻數(shù)分布分析顯示：其Sp、Pr、DI 在兩年環(huán)境條件下均呈現(xiàn)連續(xù)性分布，且2016、2017年RIL群體白粉病抗性指標(biāo)頻數(shù)分布一致（圖1）。表明抗感親本中均存在控制辣椒白粉病表現(xiàn)的基因，同時(shí)白粉病抗性還受一些微效基因控制。該群體白粉病抗性表現(xiàn)出數(shù)量性狀遺傳的特點(diǎn)，可以用作QTL分析。

表2 2016、2017年辣椒親本的白粉病抗性表現(xiàn)

表3 2016、2017年辣椒RIL 群體白粉病抗性表現(xiàn)

圖1 2016、2017年RIL 群體白粉病抗性指標(biāo)頻數(shù)分布

RIL（H3×83-60）F8群體相關(guān)性分析結(jié)果表明（表4），群體在兩年環(huán)境條件下白粉病抗性指標(biāo)相關(guān)系數(shù)在0.402～0.507之間，均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。兩年環(huán)境條件下的白粉病抗性數(shù)據(jù)相關(guān)性較強(qiáng)，均可代表不同基因型的抗性差異。

表4 2016、2017年RIL（H3×83-60）F8群體白粉病抗性鑒定相關(guān)系數(shù)

2.2 分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和遺傳圖譜的構(gòu)建

本試驗(yàn)共獲得309個(gè)多態(tài)性標(biāo)記在RIL（H3×83-60）F8群體中的基因型分析數(shù)據(jù)。通過(guò)JoinMap 4.0軟件計(jì)算，其中289個(gè)多態(tài)性標(biāo)記被劃分在16個(gè)連鎖群中，有20個(gè)標(biāo)記未被分進(jìn)任何連鎖群（表5）。所構(gòu)建的16個(gè)連鎖群可對(duì)應(yīng)在辣椒的12條染色體上，每條連鎖群上的標(biāo)記數(shù)為2～44個(gè)，連鎖群長(zhǎng)度為19.1～183.6 cM，總圖距1 356.5 cM，標(biāo)記間平均圖距為4.69 cM。其中第2連鎖群是標(biāo)記數(shù)最多的一個(gè)連鎖群，分布有44個(gè)標(biāo)記，圖距達(dá)131.2 cM，平均圖距為2.98 cM。3號(hào)染色體分為3個(gè)連鎖群P3a、P3b、P3c，4號(hào)染色體分為2個(gè)連鎖群P4a、P4b，7號(hào)染色體分為P7a、P7b 2個(gè)連鎖群（表5）。

表5 辣椒遺傳連鎖群信息

2.3 辣椒白粉病抗性QTL 定位

利用作圖軟件MAPQTL 6.0進(jìn)行白粉病抗性QTL 分 析，QTL 名 稱 由PMR（powdery mildew resistance）、染色體編號(hào)、QTL 編號(hào)組成。

從表6、7可知，基于2016年抗病鑒定的結(jié)果，共檢測(cè)到5個(gè)白粉病抗性QTLs，分別位于6、9、11號(hào)和5號(hào)染色體上，其中PMR6.1、PMR9.1和PMR11.1在3個(gè)抗性指標(biāo)中均被檢測(cè)到。PMR6.1的LOD 值為4.80～5.16，表型貢獻(xiàn)率為14.6%～15.6%，位于H6-96和H6-107標(biāo)記之間，遺傳距離為5.4 cM，物理距離為3.3 Mb；PMR9.1的LOD 值為3.49～3.72，表型貢獻(xiàn)率為10.8%～11.5%，位于P9-42和P9-43標(biāo)記之間，遺傳距離為2.9 cM，物理距離為14.6 Mb；PMR11.1的LOD 值分別為3.27～3.66，表型貢獻(xiàn)率為10.0%～11.4%。此外，在抗性評(píng)價(jià)指標(biāo)Sp16和DI16中檢測(cè)到QTL 位點(diǎn)PMR11.2，LOD 值為2.66～3.00，表型貢獻(xiàn)率為8.4%～9.4%，在Pr16和DI16中 檢 測(cè) 到QTL 位 點(diǎn)PMR5.1，LOD 值 為2.64～2.65，表型貢獻(xiàn)率為8.3%～8.5%，LOD 值及表型貢獻(xiàn)率較小。

表6 辣椒白粉病抗性QTL 定位

表7 連鎖標(biāo)記序列信息

基于2017年抗病鑒定的結(jié)果，共檢測(cè)到2個(gè)白粉病抗性QTL 位點(diǎn)，與2016年檢測(cè)到的QTL 位點(diǎn)位置一致，可以認(rèn)定為相同的QTL。PMR6.1的LOD 值為6.36～7.36，表型貢獻(xiàn)率為18.7%～21.4%；PMR9.1的LOD 值為3.06～4.95，表型貢獻(xiàn)率為11.1%～17.3%（表6、圖2）。

分析檢測(cè)到的5個(gè)與白粉病抗性相關(guān)QTL位 點(diǎn)PMR6.1、PMR9.1、PMR11.1、PMR11.2、PMR5.1，其中QTL 位點(diǎn)PMR6.1、PMR5.1加 性效應(yīng)值為負(fù)值，為減效位點(diǎn)；QTL 位點(diǎn)PMR9.1、PMR11.1、PMR11.2加性效應(yīng)值為正值，為增效位點(diǎn)。

圖2 辣椒白粉病抗性QTL 在連鎖群上的分布

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)QTL 定位分析獲得了5個(gè)白粉病 抗性QTL 位 點(diǎn)：PMR5.1、PMR6.1、PMR9.1、PMR11.1、PMR11.2，所有QTLs的總貢獻(xiàn)率為55.1%。表型貢獻(xiàn)率超過(guò)10%的位點(diǎn)有PMR6.1、PMR9.1、PMR11.1，其中PMR6.1、PMR9.1位點(diǎn)在2016、2017年均被檢測(cè)到，表型貢獻(xiàn)率在10.8%～21.4%之間，是主效QTL 位點(diǎn)。

分析2016、2017年的QTL 定位結(jié)果，2016年檢測(cè)到5個(gè)QTL 位點(diǎn)，2017年檢測(cè)到2個(gè)QTL位 點(diǎn)，PMR5.1、PMR11.1、PMR11.2在2017年 試驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)到，這可能與兩年白粉病發(fā)病情況不同有關(guān)。研究認(rèn)為辣椒白粉病抗性是由多基因控制的數(shù)量性狀遺傳，并且參與抗性的基因數(shù)目隨白粉病感染條件而變化（Ullasa et al.，1981；Desphande et al.，1985；Shifriss et al.，1992；Daubeze et al.，1995；Lefebvre et al.，2003）；如果在不同的區(qū)域和年份中群體總體抗性表型表現(xiàn)是一致的，那么個(gè)別QTL 位點(diǎn)可以表現(xiàn)出年份特異性（Daubeze et al.，1995），這進(jìn)一步說(shuō)明在不同年度、不同地點(diǎn)獲取表型進(jìn)行QTL 定位和分析的重要性。

Lefebvre 等（2003）采用與本試驗(yàn)相同的抗病親本H3，檢測(cè)到2個(gè)田間白粉病抗性QTL 位點(diǎn)Lt-6.1、Lt-9.1，本試驗(yàn)也在6、9號(hào)染色體上檢測(cè)到QTL 位點(diǎn)。此外，在5、11號(hào)染色體上檢測(cè)到3個(gè)新的QTL 位點(diǎn)PMR5.1、PMR11.1、PMR11.2，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)構(gòu)建的連鎖圖譜標(biāo)記間平均距離較小，增加了QTL 位點(diǎn)的檢測(cè)功效（李慧慧 等，2010）。

Lefebvre 等（2003）研究認(rèn)為，Lt-6.1位點(diǎn)連鎖的標(biāo)記GC002，與編碼辣椒紅素合成酶的基因（CA06g22860）連鎖，PMR6.1連鎖標(biāo)記H6-96距離GC002標(biāo)記5.5 Mb。由于研究缺乏共有標(biāo)記，故無(wú)法將本試驗(yàn)的QTL 位點(diǎn)與該研究結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，PMR6.1位點(diǎn)是否為新的QTL 位點(diǎn)，有待證明。

目前，利用抗性材料PBC167、PM Singang（C.annuum）、VK515R（C.annuum）和PRH1（C.baccatum），僅在辣椒4號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了抗性位點(diǎn)及其相關(guān)基因和多態(tài)性標(biāo)記（Gabor et al.，2017；Jo et al.，2017；Ahn et al.，2018）。本 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述相關(guān)分子標(biāo)記在材料83-60和H3間沒(méi)有多態(tài)性，而且同Lefebvre 等（2003）對(duì)抗病材料H3的遺傳定位研究一樣，均未在4號(hào)染色體發(fā)現(xiàn)抗性QTL，表明H3的白粉病抗性基因可能與上述抗性基因不同。

本試驗(yàn)利用KASPar 標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了辣椒白粉病抗性QTL 定位，為辣椒抗白粉病分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)，有利于加速辣椒抗白粉病新品種培育，也為辣椒白粉病抗性基因精細(xì)定位和克隆提供基礎(chǔ)。