張君利，劉超蘭，郭義東，林家富

(成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610052)

近年來，由于畜禽行業(yè)抗生素的過度使用，細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，使中國(guó)成為世界上動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性最嚴(yán)重的國(guó)家之一(胡燕等，2013)。臨床分離的畜禽常見病原菌(大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、巴氏桿菌Pasteurella、沙門氏菌Salmonella、肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa等)可耐受抗菌藥物達(dá)5～20種，引起了人們對(duì)動(dòng)物疾病防治的高度重視。與此同時(shí)，60%以上的人體病原菌來自動(dòng)物。一些人畜共患病原菌特別是食源性病原菌的出現(xiàn)，也對(duì)我國(guó)的動(dòng)物源食品安全和公眾健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅(Theuretzbacher，2013)。原有病原菌抗耐藥情況還未緩和，新病原菌抗耐藥又不斷出現(xiàn)，促使人類尋找新型抗生素和抗菌藥物(Olga，2017)。目前已有的生物活性物質(zhì)基本是從土壤放線菌中獲得的(譚悠久等，2011)。但是，由于陸地資源的過飽和挖掘，使得發(fā)現(xiàn)更多新化合物和新菌種越來越難。因此，人們開始把海洋、湖泊、極端環(huán)境、植物內(nèi)生等作為新的研究對(duì)象，以期利用新的生長(zhǎng)環(huán)境獲得新的微生物資源，提高新化合物及活性化合物的發(fā)現(xiàn)幾率。

本課題組前期從云貴川地區(qū)的9個(gè)湖泊沉積物中分離出244株菌，鑒定為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、厚壁菌門Firmicutes以及異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus 4個(gè)門，芽孢桿菌屬Bacillus、鏈霉菌屬Streptomyces和庫特氏菌屬Kurthia等24屬。經(jīng)過菌株的活性初篩，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬活性較好。因此，本文將從湖泊沉積物芽孢桿菌的分離、鑒定及抗動(dòng)物病原菌活性評(píng)價(jià)等方面進(jìn)行闡述，為利用湖泊來源的芽孢桿菌及其脂肽類抑菌物質(zhì)、進(jìn)一步開發(fā)抗動(dòng)物病原菌的新型微生物藥物提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 樣品來源

對(duì)云貴川地區(qū)的9個(gè)湖泊進(jìn)行深度采樣，每個(gè)湖泊采集1份水體沉積物樣品(表1)，密閉的50 mL離心管保存于冰盒，72 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 主要儀器和試劑

PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad，美國(guó))；LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器(申安，上海)；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(遠(yuǎn)懷，上海)；超凈工作臺(tái)(安泰，蘇州)；電子生化培養(yǎng)箱(東聯(lián)，哈爾濱)；1200系列液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilen，美國(guó))；LC-20AD液相色譜儀(島津，日本)；實(shí)驗(yàn)室其他常規(guī)儀器。

TIANGEN酵母基因組DNA提取試劑盒；2×TSINGKE Master Mix，10×Loading Buffer；DL2000DNA Maker；標(biāo)準(zhǔn)品98%surfactin，90%iturin(Sigma)；其他試劑均為分析純。

表1 樣品信息Table 1 Sampling information

1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：LB瓊脂培養(yǎng)基和海洋(2216E)培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；發(fā)酵培養(yǎng)基：LB肉湯培養(yǎng)基；動(dòng)物病原菌培養(yǎng)基：LB瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.4 動(dòng)物病原菌

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌Candidaalbicans均由四川抗菌素工業(yè)研究所菌保中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌株分離純化

使用稀釋涂布法分離菌株：首先將沉積物樣品放置于超凈工作臺(tái)，過夜風(fēng)干，稱取2 g，加入18 mL滅菌蒸餾水，震蕩2 h。其次將混懸液梯度稀釋至10-1～10-6，分別取100 μL懸濁液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落質(zhì)地、大小、顏色和光澤等特征，挑取形態(tài)差異明顯的單菌落。最后重復(fù)2～3次，鏡檢，將已純化的菌株于25%甘油中-80 ℃保存。

2.1.1 形態(tài)特征菌株在37 ℃的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48 h后，將細(xì)菌細(xì)胞懸浮在0.85%(w/v)的NaCl溶液中，在鍍鎳網(wǎng)上加熱干燥，并用磷鎢酸染色，使用電子顯微鏡觀察細(xì)胞的大小和形態(tài)；通過懸滴法(Bowman，2000)檢測(cè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力；通過革蘭氏染色法(Smibert，1994)鑒別菌株。

2.1.2 生理生化特征溫度：將實(shí)驗(yàn)菌株接種到LB固體培養(yǎng)基，在不同的溫度(4～50 ℃，間隔5 ℃)下培養(yǎng)，此外，在28 ℃和37 ℃培養(yǎng)菌株，確定最適生長(zhǎng)溫度和范圍。pH：將30 ℃條件下培養(yǎng)好的菌株接種到不同pH值(pH=5～11，間隔0.5)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d，觀察菌株的生長(zhǎng)情況，測(cè)定菌株在OD600時(shí)的吸光度，以確定最適生長(zhǎng)pH及范圍。鹽度耐受：在LB固體培養(yǎng)基上分別添加不同濃度的NaCl(范圍0～10%，間隔1%)(w/v)檢測(cè)菌株對(duì)NaCl的耐受程度。酶學(xué)特征：過氧化氫酶活性、氧化酶活性測(cè)定參考Cui等(2001)的方法。吲哚、明膠、七葉苷的實(shí)驗(yàn)均參考細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)。

2.2 菌株16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過DNA試劑盒提取基因組DNA。采用 20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即DNA模板2 μL，2×TSINGKE Master Mix 10 μL，27F(10 μmol·L-1)1 μL，1492R(10 μmol·L-1)1 μL，超純水6 μL。27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)為細(xì)菌通用引物。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，通過Bio-Rad凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得各菌株16SrRNA基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)，以相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA序列作為參照對(duì)象進(jìn)行種屬菌屬分類。根據(jù)菌株比對(duì)結(jié)果，采用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)以鄰接法(Neighbor-Joining)(Saitou &Nei，1987)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析各湖泊之間的菌種分布以了解不同環(huán)境之間、不同種之間、環(huán)境與種之間的關(guān)系。

2.3 菌株發(fā)酵及抗菌活性檢測(cè)

用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基上已純化菌株的適量菌體接種于裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于30 ℃、200 r·min-1的搖床培養(yǎng)2～3 d。離心取上清，加濃鹽酸調(diào)至pH2，沉淀過夜。12 000 r·min-1、30 min，離心去上清，向沉淀中加入2 mL甲醇溶解，最后過0.22 μm微孔濾膜，將甲醇浸提液通過減壓濃縮至蒸干，然后稱重，并將粗提物用甲醇再次溶解配置成10 mg·mL-1的母液備用。使用動(dòng)物病原菌進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。

采用濾紙片抑菌圈法對(duì)菌株進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，白色念珠菌接種于PDA液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r·min-1的搖床上培養(yǎng)18 h，獲得種子液。在超凈工作臺(tái)中，分別吸取100 μL種子液加入到45 ℃左右的100 mL的LB瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒平板。待平板凝固后，分別將含有約10 μL粗提物母液的滅菌濾紙片(直徑8 mm)以合適的間距放置于平板上，每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。于37 ℃培養(yǎng)24 h，同等條件下設(shè)置空白對(duì)照，觀察有無透明圈并記錄大小。

2.4 活性菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的LC-MS分析

對(duì)粗提物和配制成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行LC-MS檢測(cè)，參照標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性成分進(jìn)行分析。液相色譜條件為C18-MS-Ⅱ(2.6 mmφ×250 mm，TSK)；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 ℃；流動(dòng)相為(A)乙腈和(B)水。洗脫條件為：0～10 min，A 20%～50%，B 80%～50%；10～50 min，A 50%～65%，B 50%～35%；50～60 min，A 50%～65%，B 50%～35%；流速0.6 mL·min-1。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

質(zhì)譜條件為：ESI電噴霧；正離子模式；霧化氣壓力1.0×105Pa；毛細(xì)管電壓3 500 V；氮?dú)飧稍铮魉贋?0 L·min-1，250 ℃；掃描范圍300～1 800 m/z。

3 結(jié)果及分析

3.1 菌株分離鑒定

菌株的表型特征顯示，芽孢桿菌是一種短桿狀、無莢膜、能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陽性細(xì)菌，菌落呈光滑圓形、不透明、乳白色。生理生化特征顯示其在pH為6～8，溫度為25～37 ℃，NaCl濃度為0～5%的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好，屬于嚴(yán)格好氧或兼性厭氧菌；細(xì)胞大小為0.3～2.2 μm×2.1～7.0 μm。其中，多數(shù)菌株的VP顯示陽性；氧化酶和過氧化氫酶呈陽性；七葉苷、明膠水解，不產(chǎn)生吲哚(表2、表3)。

表2 菌株的表型特征Table 2 Phenotypic characteristics of strains

3.2 菌株16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

3.2.116SrRNA測(cè)序分類使用上述處理方法根據(jù)菌落表型特征和16S rRNA鑒定，共分離得到47株芽孢桿菌，有26種，最多的為漳州芽孢桿菌Bacilluszhangzhouensis(7株)，食丁酸芽孢桿菌Bacillusbutanolivorans和?？谘挎邨U菌Bacillushaikouensis各4株，高地芽孢桿菌Bacillusaltitudinis3株，其余各種為2株或1株(表4)。

3.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析47株芽孢桿菌自聚類分析(圖1)顯示，首先，各湖泊沉積物樣品中所分離出的菌株分別聚為一簇，說明同一環(huán)境中的菌株之間親緣關(guān)系相近；而不同地區(qū)的菌株大不相同，說明地區(qū)之間可能由于氣候和經(jīng)緯度差異，造成微生物種群差異。其次，菌株SIIA-Z556、SIIA-Z842、SIIA-Z530、SIIA-Z537和SIIA-Z531均來自邛海，且聚為一簇，可靠度達(dá)78%，同源性較高。菌株SIIA-Z858、SIIA-Z656、SIIA-Z665和SIIA-Z573均來自瀘沽湖，且聚為一簇，可靠度高達(dá)100%，同源性非常高，進(jìn)化關(guān)系極為相近，說明同一生境更易產(chǎn)生親緣關(guān)系相近的菌種。最后，來自洱海的菌株SIIA-Z536、來自紅楓湖的SIIA-Z582與邛海分離出的菌株SIIA-Z556、SIIA-Z842、SIIA-Z537、SIIA-Z530、SIIA-Z531均屬漳州芽孢桿菌，說明不同環(huán)境可以產(chǎn)生相同菌種?？梢姾瓷硨?duì)于微生物多樣性研究有著重要意義。

表3 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains

3.3 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)病原菌的活性研究

采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)47株菌株發(fā)酵粗提物進(jìn)行抗菌活性篩選(表5)。結(jié)果顯示，共13株發(fā)酵粗提物對(duì)動(dòng)物病原菌顯示出抗菌活性。其中，對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出抗菌活性的菌株較多，有10株，對(duì)白色念珠菌有抗菌活性的5株，對(duì)大腸桿菌有抗菌活性的4株，而對(duì)銅綠假單胞菌顯示出抗菌活性的僅2株。為明確活性化合物種類，將進(jìn)一步對(duì)活性菌株的發(fā)酵粗提物進(jìn)行LC-MS分析。

3.4 活性菌株代謝產(chǎn)物的LC-MS分析

對(duì)13株有抗菌活性菌株的發(fā)酵粗提物進(jìn)行LC-MS分析，結(jié)果表明，芽孢桿菌所產(chǎn)生活性化合物主要為脂肽類。通過LC-MS檢測(cè)到4種不同的質(zhì)譜峰，各活性特征峰的分子量及根據(jù)質(zhì)荷比推斷產(chǎn)物歸屬類別如表6所示。發(fā)酵粗提物中，檢測(cè)到surfactins質(zhì)子峰的芽孢桿菌9株，均為C13～C15的surfactins質(zhì)子峰，m/z=1 007.9、1 023.4和1 037.7，為相差1個(gè)亞甲基(-CH2-)的同系物；檢測(cè)到fengycins質(zhì)子峰的芽孢桿菌5株，均為C15、C16的fengycins質(zhì)子峰，m/z=1 449.3和1 464.9，也為相差1個(gè)亞甲基(-CH2-)的同系物；檢測(cè)到iturins質(zhì)子峰的芽孢桿菌6株，其中，bacillomycin L質(zhì)子峰4株，bacillomycin D質(zhì)子峰2株。分析發(fā)現(xiàn)，有14株產(chǎn)表面活性素類抗菌脂肽的芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄球菌或大腸桿菌有抑菌活性，有2株產(chǎn)豐原素類抗菌脂肽的芽孢桿菌對(duì)銅綠假單胞菌有抑菌活性，有5株產(chǎn)伊枯草素類抗菌脂肽的芽孢桿菌對(duì)白色念珠菌有抑菌活性。

表4 湖泊沉積物中分離的芽孢桿菌種類Table 4 Species of Bacillus isolates from different lake sediments

4 討論

芽孢桿菌可產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，其中大部分為脂肽類化合物，脂肽屬于非核糖體肽，而非核糖體肽是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。目前，我國(guó)對(duì)抗菌脂肽的研究還不夠深入，即使在發(fā)達(dá)國(guó)家，也是一個(gè)新的領(lǐng)域。國(guó)內(nèi)外對(duì)芽孢桿菌脂肽類化合物的研究大部分集中在抗真菌，尤其是抗植物病原真菌，只有少部分研究集中在抗細(xì)菌(李紅亞等，2017)，對(duì)抗動(dòng)物病原菌的研究則更鮮有。

據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物有表面活性素家簇、伊枯草素家簇和豐原素家簇(Tsugeetal.，2001；Koumoutsietal.，2004；Moyneetal.，2004；Chenetal.，2006)。其中，iturins和fengycins作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見植物真菌疾病的生物防治藥(Romeroetal.，2004，2007；Luoetal.，2015)。Surfactins主要對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生抑制作用(羅楚平等，2011；Zeriouhetal.，2011；Gordillo &Maldonado，2012；Meena &Kanwar，2015)。近年來，由于動(dòng)物病原菌抗耐藥情況的日益嚴(yán)重，人們開始嘗試將芽孢桿菌脂肽類化合物用于動(dòng)物病原菌的防治，效果顯著。已有研究表明，在畜禽生產(chǎn)中芽孢桿菌具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群平衡、抑制動(dòng)物病原菌、防治消化道疾病以及提高機(jī)體免疫力等作用(李紅亞等，2017)。在西方國(guó)家芽孢桿菌已被應(yīng)用于人的功能性食品和動(dòng)物飼料添加劑(葉小蘭，楊倩，2011)。與細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)相比，芽孢桿菌所產(chǎn)生的抗菌脂肽殺菌范圍更廣、效率更高、毒副作用更小、穩(wěn)定性更好。此外，抗菌脂肽對(duì)血凝、病毒和腫瘤也有很好的抗性。綜上所述，由芽孢桿菌生產(chǎn)的脂肽類抗生素在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及化妝品行業(yè)都具有巨大的應(yīng)用前景(Aarrebolaetal.，2010)。

圖1 菌株基于16S rRNA基因序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic dendrogram constructed based on 16S rRNA gene sequences

國(guó)內(nèi)外大多從土壤環(huán)境中分離產(chǎn)抗菌脂肽的芽孢桿菌，且研究對(duì)象多為單一菌株。本研究從湖泊沉積物中分離出47株芽孢桿菌，以4株常見動(dòng)物病原菌為檢定菌進(jìn)行活性檢測(cè)，篩選出13株活性菌株，LC-MS技術(shù)對(duì)13株芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物的分析顯示，有3種脂肽類抗生素，分別為表面活性素、伊枯草素和豐原素?；钚詸z測(cè)表明，脂肽類抗生素對(duì)動(dòng)物病原菌有顯著的抗菌活性。本研究為豐富特殊生境中芽孢桿菌資源在畜禽疾病控制方面的研究提供了新的菌種資源。

表5 芽孢桿菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物病原菌的抗菌活性Table 5 Antimicrobial activity of Bacillus submetabolites against animal pathogens

注：+有抑菌活性，-無抑菌活性
Notes：+bacteriostatic activity，-no bacteriostatic activity

表6 活性芽孢桿菌菌株的LC-MS分析Table 6 LC-MS analysis of active Bacillus strains