黃麗華 梁蔚陽 陳宇堃 吳偉平

國家藥品監(jiān)督管理局血液制品質(zhì)量控制重點實驗室 廣東省藥品監(jiān)督管理局血液制品質(zhì)量控制研究重點實驗室廣東省藥品檢驗所生物制品室，廣東廣州 510663

慢性乙型肝炎主要是由乙肝病毒感染所致，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報道，在全球曾感染過乙型肝炎病毒的人數(shù)約有20 億，其中感染慢性乙型肝炎的人數(shù)達(dá)到2.4 億[1-2]。慢性乙型肝炎發(fā)病率高，病情復(fù)雜，治療困難，若沒有及時治療，會逐漸發(fā)展為肝硬化、肝癌等，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[3]。目前肝移植是治療肝硬化最為有效的手段，但由于肝源有限、手術(shù)難度系數(shù)大且費用昂貴，較大地限制了肝移植的臨床應(yīng)用[4-5]。阿德福韋酯是5′-單磷酸脫氧阿糖腺苷的無環(huán)類似物，在體內(nèi)水解為阿德福韋發(fā)揮抗病毒作用，不與其他核苷類藥物（拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定）交叉耐藥，是第一個獲得美國等多個國家FDA 批準(zhǔn)用于治療慢性乙肝的一種新的核苷類似物[6-8]。

藥品檢驗是目前保證藥物質(zhì)量和安全的一個重要且有效的手段[9-11]。為了確保阿德福韋酯片微生物限度檢查法的準(zhǔn)確性和可靠性，保證藥品的用藥安全，現(xiàn)按照《中華人民共和國藥典》[12]（以下簡稱《中國藥典》）中微生物限度檢查方法，對其進行微生物限度方法適用性試驗，建立微生物限度檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CL-40M 高壓滅菌器（日本ALP 株式會社）；GRX-12A 干熱消毒箱（上海森信實驗儀器有限公司）；LRH-250A 生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）；MIR-254-PC 恒溫培養(yǎng)箱（松下健康醫(yī)療器械株式會社）；BS323S 電子天平（千分之一，賽多利斯公司）。

1.2 樣品

阿德福韋酯片由廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司星湖生化制藥廠（樣品1 批號：T161003-10；樣品2 批號：T161201-14；樣品3 批號：T161202）提供。

1.3 計數(shù)方法適用性菌種

大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）26003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由中國食品藥品檢定研究院提供，以上菌種均為第3 代。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（簡稱TSA，批號：1809214），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（簡稱SDA，批號：1072401），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（簡稱TSB，批號：1073065），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（簡稱SDB，批號：3106032），麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：1075425），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（簡稱MAC，批號：3105703）。以上培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，按使用說明書配制。使用前均進行培養(yǎng)基適用性檢查，均符合規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 計數(shù)方法適用性試驗

2.1.1 菌液的制備 分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至TSB 中，經(jīng)32℃培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)物用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 倍稀釋至含菌數(shù)≤1×104cfu/mL 的菌懸液，備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至SDB 中，經(jīng)23℃培養(yǎng)48 h 后，培養(yǎng)物用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數(shù)≤1×104cfu/mL 的菌懸液，備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至SDA 斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)23℃培養(yǎng)7 d 后，加入5 mL 含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80 的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80 的pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含孢子數(shù)為≤1×104cfu/mL 的孢子懸液。備用。接種大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，經(jīng)32℃培養(yǎng)24 h 后，培養(yǎng)物用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 倍稀釋至含菌數(shù)≤1×102cfu/mL 的菌懸液，備用。

2.1.2 供試液制備 ①1∶10 供試液制備：稱取樣品1，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用力振搖，溶解，制得1∶10 供試液。②1∶50 供試液制備：取1∶10 供試液10 mL，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50 mL，用力振搖，溶解，制得1∶50 供試液。③1∶100 供試液制備：取1∶10 供試液10 mL，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用力振搖，溶解，制得1∶100 供試液。

2.1.3 需氧菌、霉菌和酵母菌檢查方法適用性試驗 本品為抗病毒治療藥物，稀釋倍數(shù)越大，抑菌作用越小，為確定最佳的稀釋倍數(shù)，需通過預(yù)實驗進行驗證。取樣品1 按照“2.1.2”項下，配制不同稀釋倍數(shù)的供試品，平皿法（傾注法）進行。①試驗組：分別取上述菌液制備中菌數(shù)≤1×104cfu/mL 的菌懸液0.1 mL 加至10.0 mL供試液中，混勻。分別取上述1∶10 供試液1.0 mL，置直徑90 mm 的平皿中，立即傾注20 mL 溫度≤45℃熔化的培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌組傾注TSA，白色念珠菌、黑曲霉組傾注TSA 和SDA 兩種培養(yǎng)基），每株試驗菌及每種培養(yǎng)基分別平行制備2 個平皿，混勻，凝固。TSA 平皿倒置放至32℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，SDA 平皿倒置放至23℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察結(jié)果，計數(shù)。②供試品對照組：分別取上述制備好的1∶10 供試液，以稀釋液pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同試驗組操作。③菌液對照組：以稀釋液pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗?；厥毡戎?（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)。

2.1.4 控制菌檢查方法適用性試驗 阿德福韋酯片是口服制劑，根據(jù)《中國藥典》2015 年版微生物限度要求，控制菌應(yīng)進行大腸埃希菌的檢查。①試驗組：取上述1∶10供試液10 mL 及含菌數(shù)≤1×102cfu/mL 大腸埃希菌的菌懸液1 mL 加至100 mL TSB 中，32℃培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)物1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基中，43℃培養(yǎng)48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于MAC 平板上，32℃培養(yǎng)72 h。②供試品對照組：取上述制備好的供試液，以稀釋液pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液同試驗組操作。③陽性對照組：不加供試品，其他操作同試驗組。④陰性對照組：以稀釋液pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，其他操作同試驗組。

2.2 結(jié)果

2.2.1 預(yù)實驗結(jié)果 當(dāng)樣品1 配制成不同稀釋倍數(shù)的供試品，各菌株的回收比值均在0.5～2 之間，符合回收比值規(guī)定，并且回收比值均在0.8 以上，3 個稀釋級別的供試品回收比值沒有明顯差異。當(dāng)有幾種不同稀釋級別的計數(shù)方法回收比值同時達(dá)到0.5～2.0 的情況下，應(yīng)綜合考察結(jié)果的穩(wěn)定性，操作的易行性。采用最低稀釋級別的計數(shù)方法（即1∶10 供試品）作為該品種有效的檢查方法，并按照以上試驗組，供試品對照組，以及菌液對照組同時進行3 個樣品的獨立回收試驗。見表1。

表1 計數(shù)驗證不同稀釋倍數(shù)各菌株回收比值結(jié)果

2.2.2 平皿法計數(shù)方法適用性試驗回收比值 經(jīng)3 次獨立平行試驗，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌其回收比值均在0.5～2 之間，符合回收值規(guī)定，并且回收值均在0.8 以上，可見該法適用于本品的微生物檢查。見表2。

表2 阿德福韋酯片微生物檢查回收比值（1∶10 供試液，cfu）

2.2.3 控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果 本品3 個樣品控制菌試驗組與菌液對照組結(jié)果均為陽性，檢出大腸埃希菌，供試品對照組均未檢出，表明阿德福韋酯片可按照《中國藥典》2015 年版控制菌（大腸埃希菌）檢查法進行大腸埃希菌檢查，經(jīng)方法適用性試驗成立。見表3。

表3 阿德福韋酯片控制菌檢查方法適用性試驗結(jié)果

2.2.4 供試品微生物限度檢查及控制菌檢查結(jié)果 采用上述確定的檢查方法對3 批樣品進行微生物限度檢查和控制菌檢查，結(jié)果需氧菌總數(shù)＜10 cfu/g，霉菌和酵母菌總數(shù)＜10 cfu/g，均未檢出大腸埃希菌，符合2015 年版《中國藥典》口服制劑的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。見表4。

表4 3 批樣品的微生物限度檢查結(jié)果（cfu/g）

3 討論

藥品微生物限度檢查的操作步驟繁雜，周期長，對檢驗環(huán)境以及人員等環(huán)節(jié)要求高，結(jié)果受多方面的影響，檢驗過程需注重人員的業(yè)務(wù)能力及培養(yǎng)基的適用性等環(huán)節(jié)[13]，確保方法的準(zhǔn)確性和完整性。從2005 年版《中國藥典》[14]開始，已經(jīng)形成了一個比較完備的藥品微生物控制標(biāo)準(zhǔn)體系，對藥品微生物限度檢查法進行方法適用性規(guī)定，以建立適合該藥品的微生物限度檢查方法，保證藥品的質(zhì)量安全[15]。

隨著《中國藥典》2015 年版的頒布，藥品微生物限度檢查法在檢查內(nèi)容、檢查方法、培養(yǎng)體系等方面都發(fā)生了很大變化[16-17]，這給生產(chǎn)企業(yè)和藥檢機構(gòu)帶來了新的挑戰(zhàn)。藥品的微生物限度檢查以及控制是保證藥品質(zhì)量安全的重要措施[18-20]，而微生物的檢驗結(jié)果經(jīng)常會受到藥物本身及檢驗技術(shù)等多種因素的影響，因此，在進行藥品的微生物檢驗之前，需進行適用性試驗，采用經(jīng)過確認(rèn)的檢驗方法檢驗藥品，結(jié)果方屬有效[21-22]。

阿德福韋酯通過抑制乙肝病毒復(fù)制而起抗病毒治療作用[23]。為了明確其抗病毒作用不會影響微生物的檢出，因此本研究對1∶10、1∶50 及1∶100 三種不同稀釋級別的供試液均做了計數(shù)方法適用性試驗回收比值試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種不同稀釋級別的供試液回收比值均在0.5～2.0 的規(guī)定范圍內(nèi)，當(dāng)有幾種不同稀釋級別的計數(shù)方法回收比值同時達(dá)到0.5～2.0 的情況下，應(yīng)綜合考察結(jié)果的穩(wěn)定性，操作的易行性，采用最低稀釋級別的計數(shù)方法作為該品種有效的檢查方法。