于嬌妍 王慶偉 石 磊 趙 軍 張瑞濤 張 旸 徐 媛

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710038

川楝子是楝科Meliaceae 植物川楝Melia toosen-dan 的干燥成熟果實(shí)（又名金鈴子等）[1-3]，一般用作理氣、驅(qū)蟲藥，以四川產(chǎn)為道地藥材，因此叫做川楝子[4-6]。研究表明，川楝子有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抑制呼吸中樞等作用，川楝子中四環(huán)三萜類化合物川楝素為其主要成分，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一抗肉毒毒素的天然化合物，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，或誘導(dǎo)其調(diào)亡[7-13]。早期的研究主要集中于川楝素及川楝子不同提取部位的研究。目前對(duì)川楝子研究顯示川楝素可能是其主要的藥效和毒性成分[12,14-17]。

中藥藥代動(dòng)學(xué)是近年發(fā)展非常迅速的學(xué)科，它在借鑒化學(xué)藥物藥動(dòng)學(xué)方法和原理（如血藥濃度法）的基礎(chǔ)上，根據(jù)中藥“整體觀、系統(tǒng)觀”的特點(diǎn)發(fā)展了生物效應(yīng)藥動(dòng)學(xué)方法以間接推算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[17-20]，因此本研究通過對(duì)川楝子中川楝素血藥濃度的測(cè)定來研究川楝子在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，進(jìn)一步闡明川楝子的藥理作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜（島津LC-30）和質(zhì)譜儀（API 4000，AB）；TGL-20MV 離心機(jī)（湖南郝西公司）；電子分析天平（CP225D，Sartorius，十萬(wàn)分之一）；UMV-1 多管渦旋混合器（優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）；超純水機(jī)（Milli-QAdvantageA10，Milipore）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

川楝子中藥材（西安飲片廠）；川楝子醇提物（3.57 g 生藥/mL）；川楝素對(duì)照品（上海源葉生物，批號(hào)：Z11N7B24613，純度＞98%）；對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100018-200408）；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠，8～12 周，體重為250 g，購(gòu)買于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SCXK（軍）2007-007]，通過動(dòng)物倫理學(xué)審核，飼養(yǎng)條件：室溫（25±2）℃，相對(duì)濕度為（50±10）%，每天交替12 h 光照，自由飲水。

1.4 溶液的配置

1.4.1 川楝素儲(chǔ)備液及工作液的制備 精密稱取川楝素對(duì)照品3.06 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，即得306 μg/mL 的儲(chǔ)備液；取川楝素儲(chǔ)備液適量，甲醇稀釋成濃度為10.2、102.0、204.0、408.0、816.0、1224.0、1632.0、3060.0 ng/mL 系列工作液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備，另取適量?jī)?chǔ)備液制備成濃度為30.6、1224.0、2040.0 ng/mL 的低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品。

1.4.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液及工作液的制備 精密稱取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品4.13 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，即得413 μg/mL 的對(duì)乙酰氨基酚儲(chǔ)備液。取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成濃度為2070 ng/mL 內(nèi)標(biāo)工作液。

1.5 檢測(cè)條件

色譜條件：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），柱溫25℃，流動(dòng)相：乙腈-0.01%甲酸溶液（梯度洗脫，0～4 min：乙腈5%～55%；4～6.5 min：乙腈55%；6.5～9 min：乙腈55%～5%），流速：0.6 mL/min，進(jìn)樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件：掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)掃描（MRM）；離子化方式為電噴霧離子源（ESI）；噴霧電壓：3500 V；毛細(xì)管溫度：350℃；負(fù)離子模式：川楝素：m/z573.3→m/z 531.3，碰撞能（CE）為-25 eV；去簇電壓（DP）為-116 eV，對(duì)乙酰氨基酚（內(nèi)標(biāo)）：m/z 150.1→m/z 107.0，CE：-27 eV，DP：-64 eV，見圖1。

圖1 LC-MS/MS 二級(jí)質(zhì)譜圖

1.6 實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.6.1 實(shí)驗(yàn)分組和樣品采集 取雄性SD 大鼠24 只，按體重隨機(jī)分為三組，每組8 只。給藥前12 h 禁食不禁水，分別按照15、30、60 g 生藥/kg（川楝素劑量為330、660、1320 μg/kg）灌胃大鼠川楝子提取物，給藥后0、0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h 眼 眶 靜脈叢取血0.25 mL，4℃，12 000 r/min 離心10 min 離心半徑5 cm，上清液（血漿樣品）-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 樣品處理方法 精密吸取血漿樣品100 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)液，2500 r/min 渦旋5 min 使混勻，再加入400 μL 甲醇，2500 r/min 渦旋5 min，靜置3 min，離心（12 000 r/min，4℃，10 min 離心半徑）取上清至1.5 mL EP 管中，減壓抽干，殘?jiān)?00 μL 復(fù)溶液（50%乙腈-0.01%甲酸），2500 r/min 渦旋5 min 復(fù)溶，離心（12 000 r/min，4℃，10 min 離心半徑5 cm）取上清液，進(jìn)LC-MS 測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

取空白血漿，加川楝素供試品，加內(nèi)標(biāo)和川楝素供試品，給藥后血漿加內(nèi)標(biāo)樣品，按“1.6.2”項(xiàng)下方法，處理樣品，進(jìn)樣測(cè)定?？瞻籽獫{無(wú)干擾，川楝素為雙峰，依據(jù)藥典以雙峰之和計(jì)算。見圖2。

圖2 LC-MS/MS 色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

制備川楝素濃度分別為1.02、10.20、20.40、40.80、81.60、122.40、163.20、306.00 ng/mL的血漿樣品，加10 μL 內(nèi)標(biāo)液，處理后測(cè)定。測(cè)得的川楝素與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y 對(duì)濃度（X）進(jìn)行加權(quán)回歸（x-1）得回歸方程為Y=0.0185 x+0.0162（r=0.9953），川楝素血藥濃度在1.02～306 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，最低定量限為1.02 ng/mL。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度

制備川楝素濃度為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的血漿樣品各6 份，處理后連續(xù)進(jìn)樣6 次，得日內(nèi)精密度，連續(xù)進(jìn)樣6 天，得日間精密度，精密度和準(zhǔn)確度均符合要求。見表1。

表1 大鼠血漿中川楝素的精密度與準(zhǔn)確度（，n=6）

表1 大鼠血漿中川楝素的精密度與準(zhǔn)確度（，n=6）

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

制備川楝素濃度為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的血漿樣品各6 份，進(jìn)樣分析，以加入量和測(cè)得量計(jì)算提取回收率。配制川楝素低、中、高濃度分別為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的甲醇溶液各6 份；川楝素濃度為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的血漿樣品各6 份，處理后測(cè)定。計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。見表2。

表2 大鼠血漿中川楝素的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)（%，，n=6）

表2 大鼠血漿中川楝素的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)（%，，n=6）

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

制備川楝素濃度為3.06、122.40、204.00 ng/mL 的血漿樣品各6 份，分別在25℃室溫放置24 h、4℃冰箱放置7 d、-20℃冰箱反復(fù)融凍3 次，處理后進(jìn)樣。結(jié)果顯示血漿樣品穩(wěn)定性良好。見表3。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

按照“1.6”項(xiàng)下方法采集并處理血漿樣品，“1.5”項(xiàng)下液質(zhì)條件進(jìn)樣分析，采用DAS 2.0 軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。與低劑量組、中劑量組比較，高劑量組Cmax和AUC（0～t）升高，CLz/F、Vz/F 降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。繪制濃度-時(shí)間曲線（C-T曲線），見圖3。

3 討論

實(shí)驗(yàn)考察了不同方法提取大鼠血漿樣本中川楝素，因川楝素在有機(jī)溶劑中溶解度較高，因此比較了用乙酸乙酯萃取血漿中川楝素、乙腈和甲醇沉淀血漿蛋白的提取回收率，最后選擇提取回收率最高的甲醇沉淀法處理血漿樣品，并且經(jīng)驗(yàn)證該方法穩(wěn)定可靠。實(shí)驗(yàn)建立了LC-MS 法測(cè)定大鼠體內(nèi)川楝素含量的方法，能夠?qū)⒋ㄩ氐纳V峰分離，能反映樣品的真實(shí)性，并且經(jīng)驗(yàn)證所建方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏。在計(jì)算的過程中，由于川楝素化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在醛-酮式結(jié)構(gòu)的互變[21-24]，因此在色譜圖中出現(xiàn)雙峰，依據(jù)藥典以雙峰面積之和計(jì)算。

表3 不同存儲(chǔ)條件下含川楝素的血漿樣品穩(wěn)定性（，n=6）

表3 不同存儲(chǔ)條件下含川楝素的血漿樣品穩(wěn)定性（，n=6）

表4 灌胃3 種劑量川楝子提取物藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（，n=6）

表4 灌胃3 種劑量川楝子提取物藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（，n=6）

注：與低劑量組比較，*P＜0.05；與中劑量組比較，#P＜0.05。Cmax：最大血藥濃度；AUC：藥時(shí)曲線下面積；Tmax：達(dá)峰時(shí)；t1/2z：消除半衰期；MRT：平均滯留時(shí)間；CLz/F：清除；Vz/F：表觀分布容積

圖3 川楝素在大鼠體內(nèi)的C-T 曲線（n=8）

川楝子不同給藥劑量的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果顯示低、中、高3 種劑量（15、30、60 g 生藥/kg）給藥后MRT（0～∞）沒有明顯變化，Cmax，AUC（0～t），以及CLz/F和Vz/F 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨給藥劑量的增大，AUC（0～t）與劑量比例不成正比，說明川楝素在大鼠體內(nèi)為非線性動(dòng)力學(xué)過程。中劑量組的AUC（0～t）是低劑量組的1.4 倍，高劑量組的AUC（0～t）明顯高于低、中劑量組，分別是中劑量組的4.4 倍，低劑量組的6.2 倍，說明大鼠給藥劑量超過30 g 生藥/kg 后，川楝素的生物利用度會(huì)大幅度提高，藥代動(dòng)力學(xué)過程異常。15、30 g 生藥/kg 兩組間比較，隨給藥劑量CLz/F 增大1.4 倍，說明肝腎清除川楝素功能正常，但是60 g生藥/kg 給藥后CLz/F 清除率顯著降低，說明機(jī)體清除川楝素的能力降低，提示該劑量時(shí)肝腎代謝和排泄功能可能受損，機(jī)體內(nèi)川楝素蓄積，與川楝子造成肝毒性有一定關(guān)系。因此，通過其改變川楝素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)過程能夠改善川楝子所致肝毒性。