褚 未，丁 寧，唐 星*

（沈陽藥科大學 藥學院， 遼寧 沈陽 110016）

癌癥的治療涉及手術、放射治療和全身治療（化學藥物治療）中的一種或多種，低風險患者在早期疾病中通常僅通過手術治愈，但在許多情況下，綜合治療是必須的[1]。其中化療是轉移性腫瘤的主要治療方式，因為通過血流遞送有利于蓄積于癌癥部位。盡管化學療法在癌癥治療中取得了進展，但是由于單獨用藥產(chǎn)生的耐藥性會導致癌癥的復發(fā)，并且二次治療的反應率較差[2]。

因此在惡性腫瘤的臨床治療中，使用兩種作用機制不同的抗腫瘤活性成分聯(lián)合化療已成為常規(guī)使用方法，并有很好的效果。聯(lián)合藥物治療的實踐可以追溯到許多世紀前傳統(tǒng)中醫(yī)在處方中使用草藥組合的方法[3-4]，普遍來說，聯(lián)合藥物治療有機會做到減小劑量、降低毒性和減少或延緩耐藥性的產(chǎn)生，于此同時增大或維持療效[5]。聯(lián)合用藥方案的確定，需要遵守以下原則：（1）靶向于細胞周期的不同階段，可以產(chǎn)生最大細胞毒性并減小出現(xiàn)抗性的可能；（2）藥物作用機制不同以產(chǎn)生協(xié)同作用，并按照最佳劑量與周期給藥；（3）藥物毒性應控制到最小，從而降低藥物對器官組織的損傷。

吉西他濱屬于細胞周期特異性藥物，主要作用于S 期細胞，抑制DNA 合成，順鉑屬細胞周期非特異性藥物，作用于增殖周期中各期細胞，與DNA 鏈上堿基作用抑制腫瘤細胞分裂[2]。兩藥聯(lián)用時，GEM 的給藥使G1 和G2 期細胞比例增加，可以使CDDP 發(fā)揮最大效果，達到協(xié)同作用[6]，兩藥作用方式見圖1[1]。但由于兩藥理化性質與藥物代謝存在差異，吉西他濱通常受其不良藥代動力學和快速代謝失活的限制，在腫瘤部位很難達到最佳藥物比例，不可控的聯(lián)合用藥方案可能導致嚴重的不良反應。因此，需要開發(fā)一種組合藥物的遞送系統(tǒng)，以克服游離鉑藥物和吉西他濱的限制。

Fig. 1 Schematic diagram of the action mechanism of gemcitabine and cisplatin圖1 吉西他濱與順鉑細胞作用機制圖

與傳統(tǒng)小分子藥物相比，納米藥物遞送系統(tǒng)更易于控制藥物的相關性質。脂質體、納米粒、膠束等均屬于抗癌藥物遞送載體，其中脂質體是經(jīng)由美國FDA 批準的可用于癌癥治療的制劑，其脂質膜結構與活細胞膜結構相似，是具有生物相容性和可生物降解性的自組裝囊泡，而且可以降低毒性和不良反應以及減少抗腫瘤藥物在健康組織中的蓄積。另外，脂質體可以調控藥物的物理性質，例如粒徑與電位，也可以改善藥物的藥代動力學性質和藥物釋放情況。在聯(lián)合治療的藥物遞送方面，脂質體獨特的結構特點使其具有得天獨厚的優(yōu)勢，可以同時包封親水與疏水的藥物，使不同性質的藥物可以在同一脂質體系統(tǒng)內組合；增大載藥能力[7]，減小給藥頻率并降低毒性[8]；可以通過調整制備方法按比例包封與釋放藥物，使其以受控的方式發(fā)揮作用[9]，更有利于達成聯(lián)合用藥的最佳臨床效果。

作者初步考察了吉西他濱/順鉑雙載脂質體（mPEG-Gemcitabine/cisplatin-liposomes,mPEG-GEM/CDDP-LP）的體外釋放特征，同時考察了制劑的藥代動力學性質，為進一步研究mPEG-GEM/CDDP-LP 注射給藥奠定基礎。

1 儀器與材料

ACCULAB ATL-124 分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），S6000 高效液相色譜儀(華普科儀（北京）科技有限公司)，水浴恒溫培養(yǎng)搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)，nov AA 400P原子吸收光譜儀（德國耶拿分析儀器股份公司），Xevo TQ/MS 三重四級桿串聯(lián)質譜儀（美國Waters公司），VB-77 智能樣品處理儀（北京萊伯泰科公司），L-119A 樣品濃縮儀（北京來亨科貿有限責任公司），YKH-Ⅲ渦旋混合器（江西醫(yī)療器械廠），HC-3018R 高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

鹽酸吉西他濱（純度質量分數(shù)≥98%，沈陽津昌制藥有限公司），順鉑（昆明貴研藥業(yè)有限公司），大豆卵磷脂S100、DSPE-mPEG（艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司），聚谷氨酸（PLG-g-mPEG，中國科學院長春應用化學研究所），高純膽固醇（純度質量分數(shù)為95%，百靈威科技有限公司），拉米夫定（純度質量分數(shù)≥98%，大連美侖生物技術有限公司），其他試劑（分析純，市售），水為純化水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

SD 健康大鼠10 只，雄性，體質量（200 ± 20）g，沈陽藥科大學動物實驗中心提供，動物許可證號 SYXK（遼）2018-0006。

2 方法

2.1 脂質體體外釋放考察

2.1.1 脂質體與藥物溶液的相關性質

釋放實驗中所使用的mPEG-GEM/CDDP-LP 為實驗室自制的同時包載吉西他濱與聚谷氨酸-順鉑膠束的雙載脂質體，粒徑在140 nm 左右，其中吉西他濱包封率在47%左右，順鉑包封率在15%左右，且吉西他濱與順鉑藥物質量濃度比約為5∶3。GEM/CDDP-SOL 中藥物質量濃度為：吉西他濱為1 g·L-1，順鉑為0.6 g·L-1。

2.1.2 脂質體與藥物溶液中藥物的釋放

采用透析法考察吉西他濱/順鉑溶液（GEM/CDDP-SOL）和吉西他濱/順鉑脂質體（mPEG-GEM/CDDP-LP）的體外釋放行為，選擇pH 值為7.4 的PBS 緩沖液為釋放介質。

分別精密吸取GEM-CDDP-SOL、GEM-CDDP-LP 各1 mL 封裝于經(jīng)煮沸并處理好的透析袋內，扎緊后置于裝有40 mL pH 值7.4 PBS 緩沖溶液的錐形瓶中，37 ℃水浴搖床中振搖，分別于0.167、0.33、1、2、4、8、12 和24 h 吸取2 mL 釋放介質，同時補加2 mL 同溫的釋放介質，高效液相測定GEM 和CDDP 含量，按如下公式計算累積釋放百分率。

其中：ρn指某時間點測得藥物質量濃度，V 指取樣體積，V0指釋放介質總體積，mt指加入總藥量。

2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定血漿中GEM 藥物濃度

2.2.1 分析方法

色譜條件: 色譜柱為Phenomenex Kinetex XB C18柱(50 mm×21 mm, 2.6 μm)，流動相A 為含體積分數(shù)0.1%的甲酸水溶液，流動相B 為甲醇，流動相組成為A 與B 的體積比是8∶2，流速為0. 2 mL·min-1，每次進樣總時間為2 min，進樣量20 μL。

質譜條件: ESI 離子源，正離子檢測模式，毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓為20 V，源溫和脫溶劑氣溫度分別為150 ℃和400 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣( N2)流速分別為550 L·h-1和50 L·h-1，檢測的GEM 和拉米夫定的m/z 值分別為264.03、111.92 和229.92、111.91。

2.2.2 血漿樣品處理

精密量取小鼠血漿50 μL 置于離心管中，加入20 mg·L-1拉米夫定溶液20 μL 和甲醇50 μL，渦旋混合30 s，加入3.5 mL 異丙醇和乙酸乙酯混合溶液（體積比1∶2.5）渦旋混合10 min 后，6 000 r·min-1離心10 min，取上清液2 mL，氮氣吹干，400 μL 流動相復溶后，1.2×104r·min-1離心10 min，取上清液5 μL 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定。

2.2.3 標準曲線的繪制

吉西他濱標準溶液: 精密稱取鹽酸吉西他濱對照品16 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇定容，得質量濃度為160 mg·L-1的鹽酸吉西他濱標準儲備液。取鹽酸吉西他濱標準儲備液，用甲醇依次稀釋，得質量濃度分別為160、80、40、16、8、4、1.6 μg·L-1和800、400、80 ng·L-1的鹽酸吉西他濱系列標準溶液，備用。

內標溶液: 精密稱取拉米夫定標準品20 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇定容，得質量濃度為200 mg·L-1的拉米夫定標準儲備液，甲醇稀釋制得質量濃度為20 ng·L-1的拉米夫定內標溶液，備用。

取大鼠空白血漿50 μL，分別加入質量濃度分別為20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 和0.01 μg·L-1鹽酸吉西他濱系列標準溶液50 μL，配制鹽酸吉西他濱系列血漿標準溶液，按“2.2.2”條方法操作，以血漿中待測物質量濃度( ρ，μg·L-1)為橫坐標，待測物與內標峰面積的比值( A) 為縱坐標，用加權最小二乘法進行線性回歸運算，得標準曲線方程為A =2.277×10-4ρ-1.991×10-3，r2=0. 992 4。結果表明，鹽酸吉西他濱質量濃度在0.01～20 μg·L-1內與峰面積比呈良好線性關系。

2.3 原子吸收法測定血漿中CDDP 藥物濃度

2.3.1 分析方法

燈電流為6 mA，檢測波長為266.0 nm，光譜通帶寬度為0.2 nm，保護氣體為氬氣，進樣量為20 μL，干燥溫度80 ℃持續(xù)20 s、90 ℃持續(xù)20 s 、110 ℃持續(xù)10 s，灰化溫度350 ℃持續(xù)20 s、1 300 ℃持續(xù)10 s，原子化溫度2 200 ℃持續(xù)8 s。

2.3.2 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品100 μL 置于10 mL 刻度試管中，加硝酸-高氯酸（V∶V = 9∶1）混合溶液2 mL，浸泡過夜后，使用智能樣品處理儀進行消化處理，消化溫度 140 ℃，消化時間6 h，補加硝酸-高氯酸混合溶液1 mL，消化至無色，繼續(xù)加熱至160 ℃，使液體揮發(fā)近干，加蒸餾水0.2 mL趕酸，重復2 次，使酸除盡，加體積分數(shù)0.2%的硝酸定容至1 mL，渦旋10 min 混勻。

2.3.3 標準曲線的繪制

精密稱取四氯鉑酸鉀對照品2.15 mg（按Pt 計1.0 mg）置于10 mL 量瓶中，加體積分數(shù)0.2%的硝酸溶解并定容，制得按Pt 計100 mg·L-1的儲備液。精密量取上述儲備液適量，加體積分數(shù)0.2%的硝酸稀釋成按Pt 計質量濃度為0.5、1、2、5、7.5、10 和20 mg·L-1的系列溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取大鼠空白血漿100 μL，加入四氯鉑酸鉀系列標準溶液100 μL，按“2.3.2”條方法處理血漿樣品，然后配制成相當于Pt 血漿質量濃度為50、100、200、500、750、1 000 和2 000 μg·L-1的樣品溶液，進樣20 μL，記錄吸光度。以血漿中待測物質量濃度( ρ，μg·L-1)為橫坐標，待測物吸光度(A) 為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，求得直線回歸方程A=3.0×10-4ρ-4.0×10-4, r2=0. 992 6 即為標準曲線，結果表明，Pt 的質量濃度在50～2 000 μg·L-1內與吸光度呈良好線性關系。

2.4 藥物溶液的制備

GEM/CDDP-SOL 的制備：精密稱取吉西他濱原料藥10 mg、順鉑原料藥6 mg 置于10 mL 量瓶中，用生理鹽水定容，制備成按吉西他濱計1 mg·L-1、按順鉑計0.6 mg·L-1的吉西他濱/順鉑水溶液。

2.5 大鼠體內藥物動力學試驗

健康雄性SD 大鼠10 只，隨機分為2 組：一組尾靜脈注射GEM/CDDP-SOL，另1 組尾靜脈注射自制的吉西他濱/順鉑雙載藥脂質體，按吉西他濱計5 mg·kg-1、順鉑計3 mg·kg-1劑量給藥。給藥后分別于0.083、 0.25、0. 5、1、2、4、6、8、12、24 和48 h 眼眶靜脈叢取血500 μL，置肝素抗凝管中，4 000 r·min-1條件下離心10 min 分離血漿。按“ 2.2.2”和“ 2.3.2”條方法操作，高效液相色譜-串聯(lián)質譜法和原子吸收法測定，所得數(shù)值帶入標準曲線，計算血藥濃度，并計算藥物動力學參數(shù)。

3 結果

3.1 脂質體的體外釋放結果

GEM/CDDP-LP 和 GEM/CDDP-SOL 在兩種釋放介質中的體外釋放曲線見圖2。

Fig. 2 In vitro release profile of gemcitabine liposomes and gemcitabine solution(A)，cisplatin liposomes and cisplatin solution(B)圖2 吉西他濱脂質體與吉西他濱溶液（A）和順鉑脂質體與順鉑溶液（B）的體外釋放曲線

由圖2 可知，GEM/CDDP-SOL 中的GEM 和CDDP 釋放非常迅速，在最初的1 h 內幾乎全部釋放，GEM 釋放的質量分數(shù)為（95.530 9 ± 0.01）%、CDDP 釋放的質量分數(shù)為（96.307 15 ± 1.92）%，而GEM-CDDP-LP 中的GEM 和CDDP 釋放則相對緩慢，GEM 為（50.50 ± 3.62）%、CDDP 為（31.58 ±1.69）%。其中GEM 在將近8 h 后的累積釋放量為（97.26 ± 0.27）%與GEM/CDDP-SOL 的1 h點相近，可認為GEM/CDDP-LP 在10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 值7.4）中具有一定的緩釋特征，吉西他濱/順鉑脂質體體外釋放較溶液慢，其原因可能是藥物被包裹在膠束及脂質體內水相中，發(fā)揮了藥物貯庫作用，使藥物在釋放介質中緩慢釋放。

以脂質體中藥物釋放為研究對象，分別通過零級動力學方程、一級動力學方程、Higuchi 方程、Ritger-peppas 方程和Weibull 方程對體外釋放曲線進行擬合，結果見表1。從方程的相關系數(shù)可知，藥物的釋放最符合Weibull 方程，說明藥物釋放為擴散機理。

Table 1 Regression equation for drug release from liposomes表1 藥物從脂質體中釋放的回歸方程

3.2 藥物動力學結果

GEM/CDDP-LP 和GEM/CDDP-SOL 的平均血藥濃度-時間曲線見圖3。

Fig. 3 Blood concentration-time curve of gemcitabine liposomes and gemcitabine solution(A) and cisplatin liposomes and cisplatin solution(B) in rats圖3 大鼠體內吉西他濱脂質體與吉西他濱溶液（A）與和順鉑脂質體與順鉑溶液（B）的血藥濃度-時間曲線圖

經(jīng)DAS 軟件計算分析，主要藥動學參數(shù)見表2。由表2 可以看出，脂質體組的AUC0-t和AUC0-∞分別是：GEM 為12.42 mg·h·L-1和12.50 mg·h·L-1，CDDP 為19.03 mg·h·L-1和19.82 mg·h·L-1，脂質體組的AUC0-t：GEM-LP 是GEM-SOL 的2.63 倍，CDDP-LP 是CDDP-SOL 的45.86 倍。脂質體組的曲線下面積AUC 明顯大于溶液劑組，延長在體內的作用時間，表明GEM/CDDP-LP 在體內的吸收效果優(yōu)于GEM/CDDP-SOL，生物利用度更好。溶液劑注射后藥物迅速吸收，隨著藥物分布可快速代謝，血漿濃度突然下降。與溶液組相比，GEM/CDDP-LP 組的CL 明顯減小，GEM/CDDP-LP 的ρmax值明顯大于GEM/CDDP-SOL，ρmax的增加表明脂質體在增加藥物吸收方面是有效的，說明與溶液組相比，GEM/CDDP-LP 具有更長的釋放時間，表現(xiàn)出緩釋作用。

Table 2 Pharmacokinetic parameters of GEM/CDDP-LP and GEM/CDDP-SOL in rats表2 大鼠體內GEM/CDDP-LP 與GEM/CDDP-SOL 的主要藥物動力學參數(shù)

4 討論

a. 吉西他濱由于水溶性較強，導致其脂質體包封率不高，容易滲漏。制備脂質體的過程中，嘗試的逆相蒸發(fā)法可以得到較大的包封率，但其粒徑在1 μm 以上，若采取探頭超聲或擠出等方法整粒減小粒徑，會導致吉西他濱包封率迅速降至10%左右。其原因為：粒徑大時，內水相體積較大，逆相蒸發(fā)包封率與其內水相體積有關，而脂質體注射劑粒徑應在200 nm 以下為佳，因此該方法不可取。最終經(jīng)過篩選，采用薄膜分散-硫酸銨梯度法可得到較大包封率，且粒徑可控的雙載脂質體[10]。

b. 實驗中的脂質體釋放結果表示，GEM/CDDP-SOL 的釋放非常迅速，在最初1 h 內GEM 幾乎全部釋放，與GEM/CDDP-LP 中GEM 在8 h 后的累積釋放量相近，由此可認為脂質體中藥物在磷酸鹽緩沖液中有一定緩釋特征。釋放情況為兩相釋放曲線，在第一階段相對快速釋放，然后在第二階段緩慢釋放。制劑組在最初釋放階段釋放較快，這可能是由于脂質體表面吸附藥物的擴散引起的，第二階段特征在于從形成的脂質體中緩慢釋放，可能是藥物被包裹在脂質體內水相中，發(fā)揮了貯庫作用，雙層磷脂膜充當藥物的膜屏障，膽固醇的存在對磷脂雙層有穩(wěn)定作用。脂質材料中的不飽和磷脂增加了膜的流動性，使藥物緩慢釋放。

c. 吉西他濱聯(lián)合順鉑是治療非小細胞肺癌（NSCLC）的一線用藥，但兩藥均存在著給藥后在血液中快速分布全身，半衰期短的問題。這增大了兩藥的毒性以及限制了藥物的療效。脂質體由于具有組織相容性、靶向性和緩釋性等突出優(yōu)勢，因此考慮制備成脂質體改善其藥代動力學性質。結果顯示，mPEG-DSPE 修飾的脂質體可影響藥物的體內行為，具有長循環(huán)效果，同時一定程度上可提高GEM 和CDDP 在大鼠體內的生物利用度。mPEG-DSPE 為兩親性線性聚合物，PEG 具有親水性，脂質體形成過程中，DSPE 端可與磷脂膜結合，達到修飾表面的效果。

d. 通常脂質體的理化性質、表面性質、膜流動性和大小等因素是影響脂質體穩(wěn)定性和在血液中清除速率的主要因素[11]。血液中蛋白成分會導致脂質體聚集，并由于網(wǎng)狀內皮吞噬作用導致其從血流中迅速清除，脂質體帶有的負電荷可以增加藥物的循環(huán)時間，血漿和血細胞帶有負電荷，具有負表面電荷的脂質體可以通過靜電相互作用減小相互接觸，防止其聚集和黏附。采用mPEG-DSPE 修飾脂質體，使其包在脂質體的表面，可以避免脂質體被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)識別。PEG長鏈結構通過其親水性和空間排斥作用顯著減少與蛋白質的非特異性相互作用，可在脂質體表面形成電暈，提供空間穩(wěn)定性并賦予“隱形”性質，預防蛋白質吸收。基于肝臟過濾、組織外滲、組織擴散和腎臟排泄等生理參數(shù)，粒徑是長循環(huán)脂質體達到治療效果的關鍵，粒徑與蛋白質吸收之間存在相關性，小粒徑脂質體的血漿清除速率會更小，這可能是因為小粒子的表面會有更大的表面PEG 密度。脂質體表面暴露出親水性的多羥基基團，減少與血漿中血漿蛋白的結合，降低了血液成分對脂質體的清除率，從而增加其在血液中的穩(wěn)定性，增大體內循環(huán)時間，提高藥物在大鼠體內的生物利用度。