閔運(yùn)江，王廣林，黃 燕

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.皖西學(xué)院 分析測試中心，安徽 六安 237012)

鹽膚木(RhuschinensisMill.)是漆樹科鹽膚木屬[Rhus(Tourn.)L. emend. Moeneh]的一種落葉小喬木或灌木。廣泛分布于我國的除東北、內(nèi)蒙古和新疆外的其余各省區(qū)，多生長在海拔170—2700米的陽坡、曠地、路邊、林緣，也有生于溝谷、溪邊的疏林或灌叢中。印度、中南半島、馬來西亞、印度尼西亞、日本和朝鮮亦有分布[1](P99-101)。

鹽膚木是中國主要經(jīng)濟(jì)樹種之一，可供制藥和作工業(yè)染料的原料，是生產(chǎn)重要中藥材五倍子的寄主植物，其葉又為山區(qū)群眾養(yǎng)豬的野生飼料[2](P299-300)。

鹽膚木的根、葉、枝干、皮部、果實和種子均可入藥，有不少研究報道，其醇提物具有抗病毒、抗菌、抗氧化及降低膽固醇等活性[3-5]；其具有清熱解毒、舒筋活絡(luò)、散瘀止血、澀腸止瀉等功效[6-7]。

在園林綠化中，鹽膚木因其葉秋季鮮紅，枝頭果實繁多而作為觀葉、觀果的樹種?；ㄩ_于8—9月，蜜、粉都很豐富，是良好的蜜源植物[8-9]。

鹽膚木果實及其種子均含豐富的油脂，初步研究表明，野生鹽膚木果實中的油脂平均含量高達(dá)18%左右，其中以不飽和脂肪酸為主，含量可達(dá)72%，極具開發(fā)應(yīng)用價值[10-12]。

然而，鹽膚木(RhuschinensisMill)為漆樹科鹽膚木屬，與漆屬的漆樹同屬于漆樹族近緣物種，因此，鹽膚木果實及果油中，是否含有漆樹的生漆中可致敏性成分——漆酚，是研究鹽膚木油脂作為食用油脂的主要隱患之一。

R=(CH2)14CH3 orR=(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 orR=(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)2CH3 orR=(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH=CHCH3 orR=(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH2 and others圖1 漆酚的結(jié)構(gòu)簡圖

漆酚(Urushiol)在生漆中占其干重的50%～75%[13]，是一類以鄰苯二酚為主結(jié)構(gòu)的烴基酚類化合物(如圖1)，其側(cè)鏈R為不同飽和度的直鏈C15～C17的烴基，是幾個密切相關(guān)的有機(jī)化合物的混合物[14]，由于其側(cè)鏈R中包括飽和、單烯、雙烯和三烯烴基的結(jié)構(gòu)相近，極性差異小，且漆酚易氧化聚合，因此漆酚單體的分離極為困難[15-16]。

鹽膚木油脂品質(zhì)研究中卻需要純度較高的各種單一的飽和、不飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品，然而，目前國內(nèi)唯一可用的標(biāo)準(zhǔn)品是西安生漆研究所按照飽和漆酚的制備方法(GB/T 14703—2008)制備的飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品[17]。本文對西安生漆研究所提供的飽和漆酚中主要成分的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析(UPLC-MS)，初步確定其中主要成分，進(jìn)而對鹽膚木果油及鹽膚木果實醇提物中漆酚含量進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步研究鹽膚木中漆酚成分及其含量，進(jìn)而，為鹽膚木油脂食用的安全性控制提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

液-質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent 1290II/6545 Q-TOF)、超聲清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)、CO2超臨界萃取裝置(HA120-50-01-C型，南通市華安超臨界萃取有限公司)，等。

1.2 材料和試劑

飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品(西安生漆研究所)、甲醇(質(zhì)譜純，法國默克公司)、甲酸(質(zhì)譜純)、超純水、無水乙醇(分析純)、鋼瓶裝CO2(食品級)，等。

飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：

取2 mL離心管，用甲醇清洗三次，晾干備用，精確稱取飽和漆酚1.0 mg，加入1 mL甲醇，搖勻，用0.22μm的微孔濾膜過濾，得1 mg/mL飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用甲醇稀釋成所需濃度，供液相色譜-質(zhì)譜分析用。

鹽膚木果油及醇提物4個樣品的分析樣液的制備：

1#樣：鹽膚木果實乙醇提取液，用CO2超臨界萃取法，先提取出其中的油脂后，以無水乙醇作攜帶劑，提取果渣中醇溶性物質(zhì)，所得的乙醇提取液，4 ℃靜置過夜，取上清液1.0 mL，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得1#樣液。

2#樣：壓榨鹽膚木果油，鹽膚木果實經(jīng)焙炒后，小型榨油機(jī)壓榨出的毛油，桶裝冰柜內(nèi)保存，樣品制備前回溫(適當(dāng)加熱升溫?zé)崛?，吸取該油脂1.0 mL，于5 mL離心管中，加甲醇1.0 mL，充分搖勻，萃取其中多酚類物質(zhì)，4 ℃靜置過夜，取上清液(甲醇層)，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得2#樣液。

3#樣：乙醚萃取鹽膚木果油，取用無水乙醚索氏抽提法提取的鹽膚木果油1.0 mL，于5 mL離心管中，加甲醇1.0 mL，充分搖勻，萃取其中多酚類物質(zhì)，4 ℃靜置過夜，取上清液(甲醇層)，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得3#樣液。

4#樣：CO2超臨界萃取鹽膚木果油，取用CO2超臨界萃取法提取的鹽膚木果油1.0 mL，于5 mL離心管中，加甲醇1.0 mL，充分搖勻，萃取其中多酚類物質(zhì)，4 ℃靜置過夜，取上清液(甲醇層)，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得4#樣液。

1.3 實驗方法

1.3.1 超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)聯(lián)用分析的條件[18-20]

1)超高效液相色譜(UPLC)洗脫條件：Agilent Eclipse Plus C18超高效液相色譜柱(1.8 μm，2.1×50 mm)、流動相(A為0.1%甲酸水，B為甲醇)，洗脫梯度設(shè)置為：0～10 min，A∶B=90%∶10%、10～15 min，A∶B=80%∶20%、15～25 min，A∶B=20%∶80%、25～30 min，A∶B=10%∶90%、30～35 min，A∶B=0%∶100%，流速0.25 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜(MS)條件分別是：電子電離(EI)，負(fù)離子模式，電子電離電壓175 V(一級質(zhì)譜)，碰撞能40(二級質(zhì)譜)，分子分離器的霧化器噴霧壓力為35 PSI，干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度320 ℃，鞘氣溫度280 ℃，鞘氣流速11 L/min。

(2)一級質(zhì)譜電子電離電壓的優(yōu)選：優(yōu)化漆酚的一級質(zhì)譜電子電離的最佳電離電壓，分別采用145 V、155 V、165 V、175 V四個電壓梯度，對漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的一級質(zhì)譜進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2，可見電壓為175 V時，譜圖漆酚離子流(M/Z=319.268)最大、出峰最好，最后選定175 V。

(3)二級質(zhì)譜碰撞能優(yōu)化：175 V電離漆酚后二級質(zhì)譜的碰撞能優(yōu)化，選擇區(qū)間為10～40，結(jié)果如圖3，圖3中從上至下依次為10、20、30、40碰撞能譜圖，其中碰撞能為40對應(yīng)的譜圖漆酚碎片離子流(M/Z=122.037)最大、出峰最好，最后選定為40。

1.3.2 飽和漆酚及四種樣品中漆酚的定性、定量分析

按照上述1.3.1的最佳液相色譜及質(zhì)譜條件，分別對飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品和鹽膚木油脂等四種樣品進(jìn)行定性分析，結(jié)果見圖4—圖8。

由飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的液-質(zhì)聯(lián)用分析，對鹽膚木油脂等四個樣品的二級質(zhì)譜(MSMS)分析時，掃描的質(zhì)荷比定位319.268，以質(zhì)荷比(M/Z)為122.03的漆酚分子碎片離子流峰面積(響應(yīng)值)作為飽和漆酚定量分析的依據(jù)，通過飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度與峰面積(響應(yīng)值)之間的關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖9)，進(jìn)而依其回歸方程計算出1#—4#樣品中飽和漆酚的含量，結(jié)果見表2。

圖2 優(yōu)化電子電離電壓圖

圖3 優(yōu)化碰撞能圖

圖4 5種多酚類標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)中漆酚的總離子流出峰及其二級質(zhì)譜(MSMS)圖

圖5 1#樣(鹽膚木果實醇提物)離子流及其二級質(zhì)譜圖(截取部分圖)

圖6 2#樣(壓榨鹽膚木果油)離子流及其二級質(zhì)譜圖(截取部分圖)

圖7 3#樣(乙醚浸提鹽膚木果油)離子流及其二級質(zhì)譜圖(截取部分圖)

圖8 4#樣(CO2超臨界萃取鹽膚木果油)UPLC-MS離子流及其二級質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 飽和漆酚的主要成分

為分析鹽膚木果實中常見多酚類物質(zhì)，用常見多酚類物質(zhì)：沒食子酸、兒茶素、綠原酸和咖啡酸以及飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣(混標(biāo))，分析結(jié)果如圖4。

由圖4中的五種常見多酚類標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)總離子峰圖譜中，其中最右側(cè)一個峰，即保留時間為26.365 min的離子峰即是飽和漆酚。

在漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的制備過程中，側(cè)鏈R中的不飽和鍵均在蘭尼鎳催化下加H成飽和鍵，故各種原側(cè)鏈中含雙鍵的一烯漆酚、二烯漆酚等不飽和漆酚，均成為飽和漆酚。在一級質(zhì)譜中，由圖2可知，飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)UPLC-MS，負(fù)離子模式下(即[M-H]-)準(zhǔn)分子離子的質(zhì)荷比為319.2，即R為C15的飽和漆酚(總分子量320)，其二級質(zhì)譜峰質(zhì)荷比為122.0377的碎片(圖4)，由已知研究可知其結(jié)構(gòu)應(yīng)為[18]：

2.2 四種鹽膚木樣品中漆酚的定性分析

用上述的質(zhì)譜條件對1#—4#樣品進(jìn)行的一級、二級質(zhì)譜分析，見圖5—圖8。

由圖5—圖8可以看出，上述鹽膚木4種樣品中，均有m/z為122.03的分子碎片的離子峰，因此，可以確定鹽膚木四種樣品中均有飽和漆酚成分。

2.3 四種鹽膚木樣品中漆酚的質(zhì)譜定量分析

將配制好的梯度濃度的飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液，UPLC-MS分析，各自的二級質(zhì)譜用m/z為122.03的離子質(zhì)譜峰進(jìn)行定量，分析得到表1所示的結(jié)果，以濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，以離子流強(qiáng)度(信號值)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖9)。

表1 飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度及峰面積

圖9 飽和漆酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

其回歸方程為：y=5029.8x-44961；R2=0.9963。

將鹽膚木果油等4種樣品在同等條件下進(jìn)行質(zhì)譜分析，其中含飽和漆酚的同種離子的離子流強(qiáng)度(信號值)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，可分別計算出四個樣品中飽和漆酚的濃度(表2)。

表2 四個樣品中飽和漆酚含量分析結(jié)果

因此，用質(zhì)譜分析法定量檢測受試的鹽膚木果油等樣品中飽和漆酚的含量在27.5～57.5 ng/mL，即27.5～57.5 μg/L。

實驗中對飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-MS的一級質(zhì)譜分析，該飽和漆酚在負(fù)離子模式下其離子流的質(zhì)荷比為319.2，說明該飽和漆酚的分子式為C21H36O2，式量為320，即其結(jié)構(gòu)中R側(cè)鏈應(yīng)該為-C15H31的飽和烴鏈，因此，上述結(jié)果中測得的各樣品中的漆酚即是該種飽和漆酚(C21H36O2)成分的含量。

3 討論

3.1 鹽膚木油脂中漆酚含量測定樣品的預(yù)處理

鹽膚木油脂黏稠度高，成分復(fù)雜，對其進(jìn)行多酚類物質(zhì)的HPLC和UPLC-MS分析時，如果直接進(jìn)樣，一是油脂的成分出柱較慢，易殘留在色譜柱中而洗脫困難；二是油脂成分在這里是雜質(zhì)信號——噪音，多酚類成分信號相對較弱，很難達(dá)到分析所需的信噪比(S/N)≥3的要求。因此，根據(jù)漆酚等多酚類物質(zhì)易溶于甲醇或乙醇的性質(zhì)[18-20]，對鹽膚木油脂樣品進(jìn)行預(yù)處理時，取一定體積的油脂，加入等體積甲醇(質(zhì)譜純)萃取其多酚類物質(zhì)，進(jìn)而測定甲醇萃取液中多酚。

當(dāng)然，由于油脂對多酚類物質(zhì)畢竟有少量溶解，結(jié)果計算時，僅僅以甲醇萃取液中漆酚含量視為鹽膚木油脂中的漆酚含量，結(jié)果可能比鹽膚木油脂中實際含量稍低。

3.2 鹽膚木果實及果油樣品中不飽和漆酚的初步質(zhì)譜分析

由于現(xiàn)有文獻(xiàn)中，只有對漆樹中的漆酚的研究[13-16，18-20]，而未見鹽膚木果實及其油脂中漆酚成分種類及含量的報道，亦無漆酚系列成分中各單一組分，尤其是各種不飽和漆酚(即R基團(tuán)中含1—4個雙鍵)的標(biāo)準(zhǔn)品，因此，無法對樣品中的不飽和漆酚進(jìn)行精確定量測定。然而，現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，中國產(chǎn)生漆中的漆酚常見的除飽和漆酚外，尚有R側(cè)鏈為C15的含一至三個雙鍵的不飽和烴鏈，即-C15H29的一烯烴鏈、-C15H27的二烯烴鏈以及-C15H25的三烯烴鏈等，這三類不飽和漆酚的質(zhì)荷比分別是：317.2、315.2和313.2(均為負(fù)離子模式下，即-H模式下)；以此類推，R側(cè)鏈為C16的含一至四個雙鍵的不飽和烴鏈的不飽和漆酚的質(zhì)荷比分別是：331.2、329.2、327.2和325.2。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)的質(zhì)荷比，在4中樣品的UPLC-MS的一級質(zhì)譜的中，分別以各質(zhì)荷比數(shù)值進(jìn)行搜索各自的質(zhì)譜圖(共28個質(zhì)譜圖，限于論文篇幅，各質(zhì)譜圖略)，將各質(zhì)譜圖中顯示的離子流強(qiáng)度數(shù)據(jù)列入表3。

表3 四個樣品中不飽和漆酚的初步分析結(jié)果

注：表中X表示離子流強(qiáng)度(信號值)；tR表示離子流位置(即出峰時間/min)。

從表4中可見，與飽和漆酚的離子流強(qiáng)度(表中M/z=319.2的一列)進(jìn)行對比，M/z=317.2，(即含R=-C15H29的一烯烴鏈)的不飽和漆酚的含量與飽和漆酚含量相近，甚至更高一些；M/z=315.2(即含R=-C15H27的二烯烴鏈)的不飽和漆酚在4個樣品中都有，只是其的含量只有飽和漆酚的1/10左右；M/z=313.2(即含R=-C15H25的三烯烴鏈)的不飽和漆酚在4個樣品中都未檢出。

由此說明，4個樣品中側(cè)鏈R為C15的一烯不飽和漆酚含量較高，二烯不飽和漆酚也都有，但含量稍低，三烯不飽和漆酚未檢出。

再比較側(cè)鏈R為C16的各種不飽和漆酚，與R為C15的飽和漆酚含量對比，R中含一至四個雙鍵的不飽和漆酚也都有，而且二烯和三烯不飽和漆酚含量較高，與飽和漆酚含量較近或更高；一稀和四烯不飽和漆酚的含量也與飽和漆酚含量相近或略低一些。

兩者相較，不飽和漆酚種類較多，總含量也較飽和漆酚高，尤其是側(cè)鏈R為C16的各種不飽和漆酚和側(cè)鏈R為C15的一烯不飽和漆酚含量較高。

并由此推測，鹽膚木果實及其油脂中漆酚成分是飽和漆酚和不飽和漆酚的混合物，且有6種不飽和漆酚的含量多比飽和漆酚高。故本研究中所測的4個樣品中總漆酚含量應(yīng)該在165～345μg/L左右。

當(dāng)然，由于不飽和漆酚與飽和漆酚的性質(zhì)略有差異，以飽和漆酚離子流強(qiáng)度為對照分析不飽和漆酚，由于條件并非不飽和漆酚的最佳條件，所以，結(jié)果會稍有偏差。因此，關(guān)于鹽膚木油脂中不飽和漆酚的種類及其含量，尚待進(jìn)一步深入研究，以確保鹽膚木油脂食用的安全性。

4 結(jié)論

以飽和漆酚為標(biāo)準(zhǔn)對照品，UPLC-MS分析3種鹽膚木果油等4個樣品中的飽和漆酚，定性分析表明，飽和漆酚標(biāo)準(zhǔn)品中的漆酚為其分子中R為C15的飽和烴鏈，其分子式為C21H36O2，以其二級質(zhì)譜的質(zhì)荷比為122.037的分子碎片離子流強(qiáng)度作為定量分析指標(biāo)，定量分析得出，4個樣品中均含有飽和漆酚，其含量在27.5—57.5μg/L之間；7種不同結(jié)構(gòu)的不飽和漆酚的一級質(zhì)譜表明，有6種不飽和漆酚在4個樣品中的含量與飽和漆酚接近或超過飽和漆酚，因此，鹽膚木果油中飽和漆酚及不飽和漆酚的總含量在165—345μg/L左右。