吳一仙，李依秋，周怡婷，張 革，曾 颯

(1.中山大學(xué) 藥學(xué)院，廣州 510006； 2.廣州棟方生物科技股份有限公司，廣州 510800)

人們由于缺乏規(guī)律的運(yùn)動以及不健康的飲食，肥胖已經(jīng)成為當(dāng)今社會公共衛(wèi)生問題之一。當(dāng)前市面上有許多減肥藥品，成分大致為左旋肉堿、奧利司他、氯卡色林等[1]。這些減肥藥物雖然有效，但是也伴隨有惡心、頭疼、頭暈、腹瀉、油性大便等不良反應(yīng)，影響人們的身體健康。尋找既有效又安全無副作用的減肥成分迫在眉睫。

月見草(Oenotheraspeciosa)是柳葉菜科草本植物，俗稱夜來香，主要生長在北美洲東部的向陽處干燥沙地。月見草油來自低溫壓榨的月見草種子。月見草油呈淡黃色，約含有90%的不飽和脂肪酸，主要為含量約70%的亞油酸和8%～14%的γ-亞麻酸(GLA)[2]。GLA具有較強(qiáng)的生物活性，GLA在經(jīng)過人體生理轉(zhuǎn)換之后，會轉(zhuǎn)變成為激素的前趨物質(zhì)前列腺素(PGS)。PGS可以刺激棕色脂肪組織，通過粒腺體產(chǎn)生能量消耗、降低脂肪堆積[3-4]。據(jù)文獻(xiàn)[5-6]報道，口服月見草油具有降血脂與降血糖的功效，可以顯著降低肥胖大鼠血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的含量。

目前，月見草油已被廣泛用于減肥保健品，大多為口服保健品，但會伴有腹瀉副作用，故望改用外用涂抹后避免口服帶來的副作用。作為外用減肥保健品，需其有良好的透皮吸收特征。研究表明，油酸與亞油酸是常見的協(xié)同透皮吸收促進(jìn)劑[7]，并且γ-亞麻酸也展現(xiàn)了良好的透皮吸收特性[8]，這說明月見草油可以成為效果良好的外用減肥藥。月見草油含有大量的不飽和脂肪酸，容易發(fā)生氧化導(dǎo)致油脂酸敗[9]，為了提高其穩(wěn)定性，需加入油脂抗氧化劑。常用的油脂抗氧化劑有黃酮類、多酚類、多糖類等[10]。橄欖油富含豐富的多酚類抗氧化劑[11]。在芳香療法中，月見草油通常采用10%的劑量治療皮膚病[12]。因此，本研究以5%月見草油與95%橄欖油調(diào)合成復(fù)方油進(jìn)行實驗。為驗證月見草油經(jīng)透皮吸收的減脂功效，以BALB/C小鼠作為實驗動物模型，從小鼠體重增長幅度、體脂質(zhì)量、脂肪系數(shù)、Lee’s指數(shù)、脂肪細(xì)胞、血脂生化指標(biāo)以及肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平方面，研究月見草油透皮吸收的預(yù)防肥胖效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料、試劑及儀器

月見草油購自河北家豐植物油有限公司，其基本指標(biāo)見表1；橄欖油(Aladdin)；Trizol試劑(美國Invitrogen)；PrimeScriptTMRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKara)；SYBR Premix Ex Taq II實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒(TaKara)；PCR引物(上海生工)。

日立LABOSPECT003全自動生化分析儀；Nikon ECLIPSE 55i光學(xué)顯微鏡；電子天平，METTLER TOLEDO；4℃低溫離心機(jī)，BECKMAN COULTER；CFX96 Touch熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司；解剖手術(shù)器械；卷尺；無菌棉簽；多聚甲醛。

表1 月見草油基本指標(biāo)

1.1.2 實驗動物

BALB/C小鼠，48只，雄性，6周齡，無特定病原體(SPF)級，平均體重(22±2)g。實驗動物購自中山大學(xué)(實驗動物中心東校區(qū))，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2016-0029。實驗動物于屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，飼料給予充足，實驗期間動物房環(huán)境溫度為23～25℃，相對濕度為50%～60%。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗

將48只BALB/C小鼠隨機(jī)分成兩組：月見草油組(實驗組)、橄欖油組(對照組)，每組24只。實驗時，取5 mL月見草油加入95 mL橄欖油中，配制體積分?jǐn)?shù)為5%月見草油。將小鼠背部剃毛，測量體重與身長，每天定點給藥1次，用量固定為每只小鼠0.2 mL，使用無菌棉簽擦拭BALB/C小鼠背部，擦拭至棉簽無油膩感。定期每周測量小鼠體重與身長。給藥3周后，兩組分別選8只小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死，解剖取體脂(睪丸及腎周脂肪墊)。此后每隔1周進(jìn)行以上操作，直至第5周。

1.2.2 指標(biāo)觀察與檢測方法

中國石化銷售有限公司廣東肇慶分公司負(fù)責(zé)人向記者表示，該公司在肇慶開設(shè)了一個水上經(jīng)營部共有7條水上加油船，自平安西江建設(shè)以來，在肇慶海事局的大力支持下，其公司積極配合，今年省公司專批了42萬的費(fèi)用下來，目前每條水上加油船都新設(shè)了交通艇和更新了圍油欄，助力肇慶市水上突發(fā)溢油事件的應(yīng)急處置。

1.2.2.1 體重、體脂測量與脂肪細(xì)胞大小觀察

實驗前，記錄48只BALB/C小鼠的體重(g)與身長(cm)，實驗開始后每周測體重與身長。計算Lee’s指數(shù)。Lee’s指數(shù)=(體重×103)1/3/身長。

解剖小鼠取其體脂，稱重，儲存于4%多聚甲醛中固定，并不時搖動，使脂肪固定完全、充分。石蠟包埋，切片后HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察脂肪細(xì)胞大小。切取脂肪均由同一個人操作，固定位置切取脂肪，減少操作誤差。脂肪系數(shù)=體內(nèi)脂肪質(zhì)量/體重×100%。

1.2.2.2 血脂生化指標(biāo)檢測

小鼠眼球取全血，4℃下3 000 r/min離心15 min,分離血清待檢測。測定血脂生化指標(biāo)，包含血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)。

1.2.2.3 肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)水平檢測

采用Trizol法提取肝臟總RNA，測定濃度后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，實時熒光定量PCR測定脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C(SREBP1-C)、甘油三酯脂肪酶(HSL)、3-羧基-3-甲基戊二醛輔酶A還原酶(HMGCR)、低密度脂蛋白受體(LDL-R)和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(CPT1)的mRNA表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表2。實時熒光定量PCR儀擴(kuò)增條件設(shè)置為：95℃，5 min；95℃，30 s；55℃，30 s(40個循環(huán))。最后根據(jù)Ct值對mRNA進(jìn)行相對定量，采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)處理均采用Excel 2010和SPSS 23統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。采用單因素方差分析，方差齊時組間比較采用LSD法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 月見草油對小鼠體重增長的影響

月見草油對小鼠體重增長的影響如圖1所示。由圖1可看出，橄欖油組小鼠體重上升較月見草油組顯著，涂抹月見草油對小鼠體重增長有抑制作用，并在實驗開始后4周與5周，兩組小鼠體重有有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

注：*表示兩組在P<0.05水平有統(tǒng)計學(xué)差異；**表示兩組在P<0.01水平有統(tǒng)計學(xué)差異。下圖同。

圖1 小鼠體重增長趨勢

2.2 月見草油對小鼠體脂質(zhì)量的影響

月見草油對小鼠體脂質(zhì)量的影響如圖2所示。由圖2可以看出，連續(xù)涂抹后，月見草油組與橄欖油組相比，小鼠的體脂質(zhì)量明顯下降，在涂抹月見草油4、5周后，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 小鼠體脂質(zhì)量變化趨勢

體脂質(zhì)量、脂肪系數(shù)是反應(yīng)肥胖程度的重要指標(biāo)，Lee’s指數(shù)與人的體質(zhì)量指數(shù)(BIM)類似，主要反應(yīng)機(jī)體的肥胖程度。給藥5周后，測定小鼠體重、體脂質(zhì)量、脂肪系數(shù)及Lee’s指數(shù)，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，連續(xù)涂抹5周后，月見草油組與橄欖油組相比，小鼠體重、體脂質(zhì)量、脂肪系數(shù)、Lee’s指數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。月見草油組小鼠的體重、體脂質(zhì)量、脂肪系數(shù)與Lee’s指數(shù)均呈下降趨勢。

表3 給藥5周后小鼠體重、體脂質(zhì)量、脂肪系數(shù)及Lee’s指數(shù)

注：*表示兩組在P<0.05水平有統(tǒng)計學(xué)差異。下表同。

2.3 月見草油對小鼠脂肪細(xì)胞的影響

月見草油組和橄欖油組小鼠脂肪細(xì)胞的電鏡圖如圖3所示。

注：A.橄欖油組(10×);B.橄欖油組(40×);C.月見草油組(10×);D.月見草油組(40×)。

圖3 兩組小鼠脂肪細(xì)胞

由圖3可以看出，橄欖油組的小鼠脂肪細(xì)胞較月見草油組的小鼠脂肪細(xì)胞大，脂肪細(xì)胞里有明顯脂滴，顯微鏡同視野范圍內(nèi)脂肪細(xì)胞的數(shù)量減少。說明月見草油能減少脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪的累積，抑制脂肪細(xì)胞膨大。

2.4 月見草油對小鼠血脂生化指標(biāo)的影響

月見草油對小鼠血脂生化指標(biāo)的影響如表4所示。由表4可以看出：在給藥3、4周后，月見草油組小鼠血清中TC、TG與橄欖油組相比，均有減少，但無統(tǒng)計學(xué)差異；在給藥5周后，月見草油組小鼠血清TC、TG與橄欖油組相比，均有減少，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；在給藥3、4周與5周后，月見草油組小鼠血清LDL與橄欖油組相比，明顯減少，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；月見草油組之間相比，隨著給藥時間延長，LDL的含量減少，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表4 月見草油對小鼠血脂生化指標(biāo)的影響 mmol/L

注：#表示同組間在P<0.05水平差異顯著。

2.5 月見草油對小鼠肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

在肝臟脂肪代謝途徑中，固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C(SREBP1-C)是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其功能主要與下游一系列與脂肪合成相關(guān)基因有關(guān)，如激活乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)基因的表達(dá)[13]。ACC和FAS是催化脂肪酸合成的限速酶[14]。脂蛋白脂酶(LPL)、3-羧基-3-甲基戊二醛輔酶A還原酶(HMGCR)分別是TG和TC合成過程中的關(guān)鍵酶[15]。甘油三酯脂肪酶(HSL)是TG水解的關(guān)鍵酶[16]，低密度脂蛋白受體(LDL-R)基因表達(dá)的上調(diào)可以降低血清LDL水平[17]，肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(CPT1)是脂肪酸氧化的限速酶[18]。月見草油對小鼠肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響如圖4所示。

注：1.LPL；2.ACC；3.HMGCR；4.FAS；5.SREBP1-C；6.HSL；7.LDL-R；8.CPT1。

圖4 兩組小鼠肝臟脂肪代謝有關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量

由圖4可以看出，在給藥5周后，與橄欖油組相比，月見草油組的脂肪合成有關(guān)基因表達(dá)量均有下調(diào)，其中脂肪酸合成酶(FAS)mRNA、3-羧基-3-甲基戊二醛輔酶A還原酶(HMGCR)和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C(SREBP1-C)mRNA有明顯下調(diào)(P<0.05)，乙酰輔酶A羧化酶(ACC)mRNA下調(diào)最為明顯(P<0.01)，脂蛋白脂酶(LPL)mRNA下調(diào)無統(tǒng)計學(xué)意義。月見草油組的脂肪分解有關(guān)基因表達(dá)量均有上調(diào)，甘油三酯脂肪酶(HSL)、低密度脂蛋白受體(LDL-R)和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1(CPT1)均有明顯上調(diào)(P<0.01)。

3 結(jié) 論

本文以BALB/C小鼠作為實驗動物，研究涂抹月見草油對小鼠體重增長幅度、體脂質(zhì)量、脂肪系數(shù)、Lee’s指數(shù)、脂肪細(xì)胞、血脂生化指標(biāo)以及肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，涂抹月見草油對小鼠體重增長有抑制作用，降低體脂質(zhì)量，減少脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，脂肪系數(shù)與Lee’s指數(shù)均下降，血清中TG、TC、LDL的含量顯著下降。這可能是通過下調(diào)SREBP1-C，進(jìn)而抑制下游有關(guān)脂肪合成基因ACC、FAS、LPL和HMGCR的表達(dá)，激活與脂肪分解相關(guān)基因HSL、CPT1和LDL-R的表達(dá)，進(jìn)而抑制脂肪生成，促進(jìn)脂肪分解，降低血脂含量。說明外用涂抹月見草油可以起到減脂、預(yù)防肥胖的效果。