張娟 賴春田 王海燕 鄒聞達(dá) 彭娟 朱力宇 李輝

[摘要] 目的 探討重型α-地中海貧血胎兒羊水源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建立及鑒定。 方法 對(duì)胎兒被診斷為重型α-地中海貧血（--SEA/--SEA）的孕婦（16+周）進(jìn)行超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺術(shù)，抽取10 mL羊水。利用非整合型仙臺(tái)病毒介導(dǎo)Sox2、Klf4、c-Myc、Oct 3/4 四種轉(zhuǎn)錄因子將重型α-地中海貧血胎兒的羊水細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）;通過堿性磷酸酶（ALP）染色，免疫熒光標(biāo)記（IF）檢測(cè)等對(duì)iPSCs進(jìn)行多能性鑒定;通過擬胚體（EB）的形成和自發(fā)分化實(shí)驗(yàn)對(duì)iPSCs在體內(nèi)外3個(gè)胚層細(xì)胞分化的能力進(jìn)行鑒定;同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞核型分析及缺失型α-地中海貧血基因診斷。 結(jié)果 仙臺(tái)病毒可以成功地將重型α-地中海貧血胎兒的羊水細(xì)胞重新編程為非整合型誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（h-AF-SeV-iPSCs）;ALP染色呈強(qiáng)陽性;IF檢測(cè)顯示Sox2、Oct4、SSEA-4、Tra-1-81表面特異性蛋白表達(dá)為陽性;h-AF-SeV-iPSCs懸浮培養(yǎng)均能形成囊性EB，貼壁培養(yǎng)后3個(gè)胚層均能分化;h-AF-SeV-iPSCs第10代及第20代細(xì)胞染色體核型均為正常核型（46，XY）;且h-AF-SeV-iPSCs及其原代羊水細(xì)胞的重型α-地貧基因檢測(cè)均為--SEA/--SEA缺失型。 結(jié)論 h-AF-SeV-iPSCs可作為研究重型α-地中海貧血胎兒宮內(nèi)治療的理想細(xì)胞模型，羊水細(xì)胞可作為iPSCs的理想細(xì)胞來源。

[關(guān)鍵詞] 重型α-地中海貧血;羊水細(xì)胞;誘導(dǎo)多能干細(xì)胞;仙臺(tái)病毒

[中圖分類號(hào)] R714.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）09（c）-0018-06

Establishment and identification of induced pluripotent stem cells sourced fetal amniotic fluid cells of a fetus with severe α-halassemia

ZHANG Juan? ?LAI Chuntian? ?WAND Haiyan? ?ZOU Wenda? ?PENG Juan? ?ZHU Liyu? ?LI Hui

Department of Reproductive Center， Zhuzhou Central Hospital， Hu′nan Province， Zhuzhou? ?412007， China

[Abstract] Objective To explore the establishment and identification of induced pluripotent stem cells sourced fetal amniotic fluid cells of a fetus with severe α-halassemia. Methods Ultrasound-guided amniocentesis was performed on pregnant women （16+ weeks） whose fetus was diagnosed with severe α-halassemia（--SEA/--SEA）， 10 mL of amniotic fluid was extracted. The amniotic fluid cells of a fetus with severe α-halassemia which were reprogrammed into induced pluripotent stem cells （iPSCs） by non-integrated sendai virus mediated transcription factors of Sox2， Klf4， c-Myc， Oct 3/4. IPSCs were multifunctionally identified by alkaline phosphatase （ALP） test and immunofluorescence （IF） labeling. The ability of iPSCs to differentiate outward from three endodermal cells in vivo was identified by embryoid （EB） formation and spontaneous differentiation test. Cell karyotype analysis and genetic diagnosis of type α-thalassemia were performed. Results Sendai virus could successfully reprogram the amniotic fluid cells of a fetus with severe α-halassemia into non-integrated induced pluripotent stem cells （h-AF-SeV-iPSCs）. H-AF-SeV-iPSCs were strongly positive of ALP staining， and embryonic stem cells specific proteins of SOX2， Oct4， SSEA-4 and Tra-1-81 were positive expressed of IF staining. After the suspension culture of h-AF-SeV-iPSCs， the cystic EB body could be formed， and after the adherent culture， it could also differentiate into the three germ layers. The karyotype analysis of chromosome in the 10th and 20th generation of h-AF-SeV-iPSCs were normal （46， XY）. H-AF-SeV-iPSCs and its primary amniotic fluid cells were all detected as --SEA/--SEA. Conclusion The h-AF-SeV-iPSCs could be used as an ideal cell model for study of intrauterine treatment of a fetus with severe α-halassemia， and amniotic fluid cells could be used as an ideal cells source for iPSCs.

[Key words] Severe α-halassemia; Amniotic fluid cells; Induced pluripotent stem cells; Sendai virus

地中海貧血（以下簡(jiǎn)稱“地貧”）是由于珠蛋白肽鏈合成受到阻礙或完全被抑制，導(dǎo)致血紅蛋白（Hb）組成異常，引起慢性溶血性貧血。不同類型的珠蛋白基因缺失或缺陷，可引起相應(yīng)的珠蛋鏈合成受抑制，可將其分為α-地貧、β-地貧、δ-地貧、γ-地貧，及少見的δβ-地貧[1]，前兩種類型較為常見。各類地貧內(nèi)部及與各異常Hb之間可相互組合（如Hb E/β地貧），這一系列病況又稱地貧綜合征，均屬于不完全顯性常染色體遺傳病。α-地貧（α-mediterraneananemia）是由于α-珠蛋白基因的缺失或功能缺陷（點(diǎn)突變），導(dǎo)致α-珠蛋白鏈合成障礙所引起的一組溶血性貧血[2]。重型α-地貧如Hb Bart′s胎兒水腫綜合征是由于4個(gè)α-珠蛋白基因缺少導(dǎo)致，胎兒出現(xiàn)嚴(yán)重的貧血癥狀，如不及時(shí)進(jìn)行宮內(nèi)治療，大多數(shù)胎兒在孕晚期會(huì)發(fā)生死亡[3-4]。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）技術(shù)是將體細(xì)胞重新編程為PSCs。選擇已終末分化的干細(xì)胞導(dǎo)入特定轉(zhuǎn)錄因子，分化的細(xì)胞在特定條件下被逆轉(zhuǎn)后，恢復(fù)至全能性狀態(tài)或形成胚胎干細(xì)胞系（ESC）或進(jìn)一步發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體的過程[5-6]。iPSCs的出現(xiàn)，避免了一些倫理問題及免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)。目前，使用iPSCs治療β-地貧的報(bào)道較多，但是將iPSCs用于治療重型α-地貧的研究剛起步，而且重型α-地貧在生殖領(lǐng)域還沒有良好的解決方案。因此，iPSCs對(duì)重型α-地貧的治療研究將是一個(gè)重要的研究方向。本課題選擇用非整合仙臺(tái)病毒將重型α-地貧胎兒的羊水細(xì)胞轉(zhuǎn)換成iPSCs，為重型α-地貧機(jī)制的探討構(gòu)建細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用的羊水細(xì)胞來源自株洲市中心醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱為“我院”）產(chǎn)前診斷中心。2017年10月，一對(duì)攜帶SEA型地貧DNA的夫婦，到我院行產(chǎn)前介入性檢查，女方孕齡16+周，共抽取20 mL羊水，一部分用于地貧DNA驗(yàn)證，結(jié)果顯示--SEA/--SEA缺失型;另一部分捐贈(zèng)給本課題組。夫婦均知情同意，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6～8周齡重癥聯(lián)合免疫缺陷（Server combined immune-deficiency，SCID）小鼠4只，雌雄各半，體重25～33 g，合格證號(hào)：SCXK（京）2015-0001;8～10周美國(guó)癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠4只，雌雄各半，體重26～32 g，合格證號(hào)：SCXK（京）2015-0001;均購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。本研究通過中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備與試劑

實(shí)驗(yàn)所需儀器設(shè)備、試劑均由具有合法資質(zhì)的企業(yè)生產(chǎn)、供應(yīng)，均檢驗(yàn)合格，試劑盒均按照操作說明嚴(yán)格執(zhí)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）的制備

對(duì)8～10周ICR小鼠進(jìn)行激素刺激，使小鼠均在同期發(fā)情，且雌鼠超數(shù)排卵，為保證交配，按2：1的比例將雌、雄鼠同籠喂養(yǎng)。將帶有陰道栓的雌鼠單籠飼養(yǎng)0.5 d。選擇12.5～13.5 d的孕鼠經(jīng)頸椎脫臼后結(jié)束妊娠，75%的酒精浸泡消毒后解剖。取出的子宮浸泡在磷酸鹽緩沖液（PBS）中（含雙抗），然后去除胎鼠的頭、尾、內(nèi)臟和四肢，用PBS（含雙抗）潤(rùn)洗軀干。剪刀物理分解軀干后，將碎小組織倒入EP管（50 mL）中，加入10 mL 0.05%胰酶消化組織5 min（晃動(dòng)，37℃水浴箱），隨后使用FM培養(yǎng)基停止消化。取細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，去除上清液，F(xiàn)M培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并接種于10 cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（P0代）。待MEF匯合度≥100%時(shí)，0.05%胰酶消化細(xì)胞，隨后以1：3的比例傳代。把MEF（P2代或P3代）制成小鼠飼養(yǎng)層細(xì)胞（Feeder）。

1.2.2 Feeder制備

MEF匯合度為100%時(shí)，使用PBS潤(rùn)洗2遍，加入含10 mg/mL絲裂霉素C的MEF培養(yǎng)基4 mL，培養(yǎng)箱內(nèi)放置3 h后，去除培養(yǎng)基，PBS潤(rùn)洗3次，0.05%胰酶消化細(xì)胞，隨后1000 r/min離心5 min，去除上清液。將細(xì)胞凍存留種，每?jī)龃婀?06個(gè)細(xì)胞，可用于5個(gè)培養(yǎng)皿（35 mm）的細(xì)胞復(fù)蘇。

1.2.3 羊水細(xì)胞采集及培養(yǎng)

B超定位穿刺吸取羊水10 mL，1000 r/min離心5 min，去除上清液，4 mL BIOAMF-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周后替換成干凈的羊水培養(yǎng)基，去除沒有附著在培養(yǎng)皿壁上的細(xì)胞。當(dāng)羊水細(xì)胞匯合度為70%～80%時(shí)，0.05%胰酶消化，并按1∶4的比例傳代，傳代細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.4 羊水細(xì)胞重編程

在12孔板上，按每孔1.0×105～1.5×105個(gè)羊水細(xì)胞接種2孔，其中1孔用0.05%胰酶消化，室溫靜置直至細(xì)胞出現(xiàn)脫落，添加1 mL羊水細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，隨后倒入15 mL圓錐離心管，1000 r/min離心5 min，計(jì)數(shù)，然后按照實(shí)際細(xì)胞的數(shù)量衡量亟待添加的仙臺(tái)病毒的數(shù)量（kos MOI=5，hc-Myc MOI=5，hklf MOI=3）。將仙臺(tái)病毒放在37℃水浴箱中5～10 s，解凍，超速離心后立即放入冰塊中。將1 mL含有仙臺(tái)病毒的羊水細(xì)胞培養(yǎng)基升溫到37℃，匯入另1孔羊水細(xì)胞后置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱過夜孵育。轉(zhuǎn)導(dǎo)24 h后用新鮮的羊水細(xì)胞培養(yǎng)基替換含有仙臺(tái)病毒的羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，每隔1 d更新培養(yǎng)液，連續(xù)6 d，最后1 d制備Feeder培養(yǎng)皿。

第7天時(shí)使用0.05%胰酶0.5 mL消化轉(zhuǎn)導(dǎo)仙臺(tái)病毒的細(xì)胞，1 mL羊水細(xì)胞培養(yǎng)基（常溫）終止細(xì)胞消化，最后全部轉(zhuǎn)至EP管（15 mL），1000 r/min離心5 min，去除上清液后再次懸浮細(xì)胞，將其接種于Feeder上，細(xì)胞密度為2×104、4×104個(gè)。從第2天開始用iPSCs培養(yǎng)液替掉羊水細(xì)胞培養(yǎng)基，每天更換培養(yǎng)液，第8天既可隔日在顯微鏡下觀察克隆體形成與否。轉(zhuǎn)導(dǎo)仙臺(tái)病毒3～4周后，選擇物理方法挑選克隆生長(zhǎng)的具備核仁明顯以及邊界清晰的單細(xì)胞集落，在覆蓋基質(zhì)膠（matrigel）或Feeder的培養(yǎng)皿中接種培養(yǎng)。

1.2.5 iPSCs的培養(yǎng)以及傳代

iPSCs在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d后，借助體視學(xué)顯微鏡及1 mL注射器針頭把克隆體分成多個(gè)小細(xì)胞團(tuán)塊，將其以1∶4的比例接種于包被飼養(yǎng)層或覆蓋matrigel的培養(yǎng)皿中。前5代的細(xì)胞傳代均選擇機(jī)械切割法。從第6代開始，當(dāng)細(xì)胞匯合度≥80%時(shí)，使用分散酶（dispase）或0.5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（Ethylenediamine tetraacetate disodium，EDTA）消化細(xì)胞，每天以iPSC/mTeSR1培養(yǎng)基更新舊的培養(yǎng)液，保證細(xì)胞正常傳代。

1.2.6 多能性鑒定

1.2.6.1 堿性磷酸酶（ALP）染色? 去除舊培養(yǎng)液，PBS換洗培養(yǎng)皿2、3次，4%多聚甲醛（PFA）固定細(xì)胞1～2 min，吸掉PFA后，使用PBS和TBST緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞，各2次。將溶液A（瓶蓋白）、溶液B（瓶蓋綠）、溶液C以50∶12.5∶437.5的劑量在室溫、避光前充分混合，隨后完全遮住孔底靜置15～20 min，棄染色液后可用PBS潤(rùn)洗1次，倒置顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照?；钚暂^好的ALP集中出現(xiàn)在未分化細(xì)胞中，故通過ALP染色結(jié)果驗(yàn)證干細(xì)胞是否發(fā)生分化，分型方法包括藍(lán)/紫色表示未分化細(xì)胞;無特殊顯色表示分化細(xì)胞。

1.2.6.2 免疫熒光標(biāo)記（IF）檢測(cè)? 表面特異性蛋白會(huì)在胚胎干細(xì)胞表達(dá)，通過對(duì)Sox2、Oct4、SSEA-4和Tra-1-81的抗原IF染色，完成iPSCs的多能性檢測(cè)。IF染色需滿足iPSCs接種后細(xì)胞匯合度長(zhǎng)至50%～60%。具體流程見下：

①固定：去掉舊的培養(yǎng)基，常溫PBS潤(rùn)洗3次，每次10 min;4% PFA室溫下固定細(xì)胞20～30 min;②透膜：PBS潤(rùn)洗3次，每次10 min，0.5%細(xì)胞通透劑TritonX-100通透細(xì)胞10 min;③封閉：PBS潤(rùn)洗3次，10 min/次，室溫下5%牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）封閉細(xì)胞60 min;④一抗：加入對(duì)應(yīng)一抗的試劑配比，分別為SSEA4 1∶100、Oct4 1∶500、Tra-1-81 1∶100、Sox2 1∶100。4℃過夜孵育完成抗原抗體反應(yīng);⑤二抗：PBS潤(rùn)洗3次，10 min/次，去掉一抗;室溫下加入1∶500熒光的二抗（1 μg/mL），避光染色1 h;⑥核染：PBS洗3次，10 min/次，去掉二抗，用l μg/mL 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色10 min;⑦拍照：PBS潤(rùn)洗3次，10 min/次，去掉DAPI。將細(xì)胞轉(zhuǎn)至專用載玻片上，在激光共聚焦倒置顯微鏡下拍照、并分析IF染色的結(jié)果。

1.2.7 擬胚體（EB）的形成與自發(fā)分化

1 mg/mL Dispase液消化iPSCs細(xì)胞成小團(tuán)塊，1000 r/min離心5 min，去掉上清液，EB培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，接種前述團(tuán)塊于低吸附培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);間隔一日更換培養(yǎng)液，連續(xù)7 d;把EB貼壁培養(yǎng)于4孔板（0.1%明膠包被）內(nèi)，隔日替換培養(yǎng)液至第14天;IF染色觀察3個(gè)胚層（AFP-內(nèi)胚層、SMA-中胚層和Nestin-外胚層）的分化情況。

1.3細(xì)胞的核型分析

①細(xì)胞培養(yǎng)：iPSCs傳代3～4 d后，分析在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的細(xì)胞核型;②秋水仙素的處理過程：將加入秋水仙素（終濃度0.25 μg/mL）的細(xì)胞置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后，0.05%胰酶消化成單體細(xì)胞，收集至15 mL的EP管中，1000 r/min離心5 min，去除上清液;③低滲：沿EP管側(cè)壁小心加入3、4滴新鮮配制的低滲混合液（0.4%枸櫞酸鈉∶0.4%KCl=1∶1）共計(jì)1 mL輕柔混勻，37℃水浴箱6 min加速反應(yīng)過程;④預(yù)固定：加入7滴即刻配制的固定液（冰醋酸∶甲醇=3∶1），利用吹打動(dòng)作在水浴箱消掉氣泡預(yù)固定，1 000 r/min離心5 min;⑤固定：去除上清，進(jìn)一步打入4 mL前述固定液沖勻氣泡，靜置40 min，1000 r/min離心5 min。去除上清液，第3次混入2 mL固定液放置20 min，1000 r/min離心5 min，去除上清液;⑥滴片及烤片：從高處滴入固定液到冰水玻片打散氣泡，迅捷掃過3遍酒精燈。60℃過夜靜待反應(yīng);⑦Giemsa染色：室溫下，Giemsa染色10 min后，PBS潤(rùn)洗染料晾干備用。⑧結(jié)果分析：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取≥20個(gè)細(xì)胞中期用Leica染色體軟件觀察及分析。

1.4 缺失型α-地貧的DNA診斷

冰箱中取出PCR 8連管，“short”離心，賦予編號(hào);用加樣槍打入2 μL待測(cè)樣于PCR 8連管中，陰/陽性對(duì)照也需一并打入;將前述8連管進(jìn)行PCR擴(kuò)增。配制1%瓊脂糖凝膠板，0.3 g瓊脂糖粉與30 mL 1× TBE在干凈的三角燒瓶中加熱混勻，當(dāng)溫度降至50～60℃時(shí)加入1.5 μL Gold View后灌膠于膠板中，室溫凝固至少30 min。拔出用于制備準(zhǔn)確間隔加樣槽的梳子，將膠板浸入含1× TBE的電泳槽中，將4 μL PCR產(chǎn)物依次點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠（DNA大小分別是 0.9、1.2、1.4、1.7和2.0 kb），反應(yīng)條件為130 V、45 min，用凝膠成像儀觀察電泳完的凝膠，根據(jù)圖像分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.0、1.7、1.4、1.2、0.9 kb擴(kuò)增帶依次對(duì)應(yīng)右側(cè)缺失（-α 3.7）、無缺失、左側(cè)缺失（-α 4.2）、東南亞型缺失（--SEA）、泰國(guó)型缺失（--THAI）。

2 結(jié)果

2.1 重型α-地貧胎兒羊水中細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后的重癥α-地貧胎兒羊水細(xì)胞長(zhǎng)成了幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的細(xì)胞小島。更換培養(yǎng)液2 d后，細(xì)胞生長(zhǎng)更加旺盛形成多個(gè)細(xì)胞集落。細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)可按1：4傳代羊水細(xì)胞，后者整體生長(zhǎng)形態(tài)似梭形或者不規(guī)則三角形，細(xì)胞核呈現(xiàn)卵圓形，見圖1。

2.2仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)下重新的編程結(jié)果

4種轉(zhuǎn)錄因子（Sox2、Klf4、c-Myc 及Oct3/4）通過仙臺(tái)病毒介入第2代羊水細(xì)胞中。羊水細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞樣克隆現(xiàn)象會(huì)出現(xiàn)在轉(zhuǎn)導(dǎo)的第4天。胰酶消化轉(zhuǎn)導(dǎo)第7天的羊水細(xì)胞，而后以2×104、4×104個(gè)的密度接種，轉(zhuǎn)導(dǎo)后陸續(xù)可見克隆樣生長(zhǎng)細(xì)胞（第9天），清晰界限位于克隆與周圍飼養(yǎng)層細(xì)胞間（第13天），見圖2A;克隆體越來越大，緊密排列的細(xì)胞間存在無法忽視的核仁且核漿比高，與周圍飼養(yǎng)層細(xì)胞邊限清楚（第20天），見圖2B。1 mL注射器針頭將克隆體切割接種傳代，一部分在Matrigel包被的4孔板中;一部分在飼養(yǎng)層細(xì)胞包被的培養(yǎng)皿中，此過程各自使用無動(dòng)物血清的mTeSR1培養(yǎng)基以及iPSC培養(yǎng)基培養(yǎng)。4～5 d克隆體傳代1次，第5代后干細(xì)胞形態(tài)仍保留，見圖2C～D。轉(zhuǎn)導(dǎo)6×104個(gè)仙臺(tái)病毒，接種在飼養(yǎng)層的羊水細(xì)胞會(huì)顯現(xiàn)含有30個(gè)胚胎的干細(xì)胞樣克隆體-非整合型誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（h-AF-SeV-iPSCs），經(jīng)AP染色結(jié)果為陽性，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在0.05%左右。

A：h-AF-SeV-iPSCs，第13天;B：h-AF-SeV-iPSCs，第20天;C：第5代無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的 h-AF-SeV-iPSCs;D：第5代有飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的 h-AF-SeV-iPSCs

2.3 ALP染色結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的iPSCs著色明顯。見圖3。

2.4 IF檢測(cè)結(jié)果

IF檢測(cè)顯示Sox2、Oct4、SSEA-4、Tra-1-81表面特異性蛋白陽性表達(dá)。見圖4（封三）。

2.5 EB形成與自發(fā)分化結(jié)果

低吸附皿中，h-AF-SeV-iPSCs懸浮培養(yǎng)均能形成囊性擬胚體，見圖5A（封三）;貼壁培養(yǎng)后3個(gè)胚層均能分化，圖5B（封三）。

2.6 染色體核型分析結(jié)果

核型分析發(fā)現(xiàn)，第10代和第20代 h-AF-SeV-iPSCs染色體核型都是正常的核型（46，XY）。見圖6。

2.7 重型α-地貧的DNA診斷結(jié)果

h-AF-SeV-iPSCs及其原代羊水細(xì)胞的重型α-地貧基因檢測(cè)均為--SEA/--SEA缺失型。見圖7。

3 討論

越來越多的研究報(bào)道指出，雖然宮內(nèi)干預(yù)和產(chǎn)后重癥監(jiān)護(hù)能改善重型α-地貧胎兒的存活情況，但較多的存活胎兒仍合并不同程度、不同類型的并發(fā)癥（呼吸窘迫、水腫、貧血等），通常需要終身治療，嚴(yán)重影響了新生兒的生長(zhǎng)發(fā)育[8-9]。有研究顯示，宮內(nèi)治療能減少重型α-地貧胎兒的并發(fā)癥，降低水腫的發(fā)生情況，從而降低窒息的風(fēng)險(xiǎn)[10]。重型α-地貧的宮內(nèi)造血干細(xì)胞（HSC）移植治療效果并不是很理想，仍需進(jìn)行宮內(nèi)輸血治療。而HSC來源問題是宮內(nèi)HSC移植療效不佳的重要因素。因此，采用患者來源的iPSCs對(duì)重型α-地貧胎兒進(jìn)行宮內(nèi)治療具有非常重要的意義[11-12]。

現(xiàn)階段，β-地貧為iPSCs治療的重點(diǎn)，而α-地貧的研究報(bào)道少見。有報(bào)道利用質(zhì)粒誘導(dǎo)技術(shù)重新編程α-地貧患者的成纖維細(xì)胞株形成iPSCs，使用同源重組技術(shù)將外源α-珠蛋白基因嵌入，通過基因修復(fù)技術(shù)使iPSCs分化成紅細(xì)胞，繼而表達(dá)α-珠蛋白鏈，平衡α/β珠蛋白鏈的表達(dá)[13-14]?；?qū)⒅匦挺?地貧胎兒的皮膚成纖維細(xì)胞通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染變?yōu)閕PSCs[15-16]。因此，對(duì)羊水來源的α-地貧特異性iPSCs的建立及修復(fù)具有非常重要的意義。

其他來源細(xì)胞比羊水細(xì)胞在重新編程上存在劣勢(shì)。第一，羊水細(xì)胞含有羊水干細(xì)胞，與其他細(xì)胞相比，細(xì)胞相對(duì)“年輕”（胚胎一樣的表觀遺傳學(xué)背景）。羊水細(xì)胞可快速、高效、簡(jiǎn)單地誘導(dǎo)成PSCs。第二，微創(chuàng)抽取羊水診斷是行之有效的最佳方案，且10 mL的細(xì)胞量足以保證后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。第三，由于羊水細(xì)胞相對(duì)年輕，它引起周圍環(huán)境突變的可能性微乎其微，而且遺傳物質(zhì)更穩(wěn)定[17]。研究人員發(fā)現(xiàn)，再次激活Oct4基因并經(jīng)過valproic acid（VPA）修飾的羊水細(xì)胞可以表現(xiàn)出類胚胎干細(xì)胞活性與功能[18-19]。

本研究使用仙臺(tái)病毒將重型α-地貧胎兒的羊水細(xì)胞誘導(dǎo)成多功能干細(xì)胞。經(jīng)仙臺(tái)病毒介導(dǎo)的羊水細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)4 d后，可以觀察到胚胎干細(xì)胞樣的羊水細(xì)胞克隆;羊水細(xì)胞經(jīng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的第7天，胰酶消化完轉(zhuǎn)入飼養(yǎng)層細(xì)胞，克隆細(xì)胞在培養(yǎng)第2天出現(xiàn)。與文獻(xiàn)報(bào)道的克隆時(shí)間比較[20-21]，其他成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)的PSCs顯著減少。因此，iPSCs治療的理想細(xì)胞來源可選羊水細(xì)胞。仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)PSCs只需權(quán)衡細(xì)胞添加轉(zhuǎn)染試劑的量，未整合外源基因到宿主基因組中，操作簡(jiǎn)單、安全、高效、簡(jiǎn)便。本課題誘導(dǎo)效率在0.05%左右，與文獻(xiàn)報(bào)道[14]基本一致。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的h-AF-SeV-iPSCs和胚胎干細(xì)胞形態(tài)相同，干細(xì)胞相關(guān)多能性檢測(cè)顯示ALP染色明顯;IF檢測(cè)顯示Sox2、Oct4、SSEA-4、Tra-1-81表面特異性蛋白陽性表達(dá);h-AF-SeV-iPSCs懸浮培養(yǎng)均能形成囊性EB，貼壁培養(yǎng)后3個(gè)胚層均能分化，說明h-AF-SeV-iPSCs在體外具有向3個(gè)胚層分化的能力;核型分析發(fā)現(xiàn)，第10代和第20代h-AF-SeV-iPSCs染色體未出現(xiàn)異常，說明仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的羊水細(xì)胞即便經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的體外培養(yǎng)，依舊可以通過正常染色體核型的維持來保障穩(wěn)定的物質(zhì)遺傳過程，足以安全保障治療未來疾病;h-AF-SeV-iPSCs及其原代羊水細(xì)胞的重型α-地貧基因檢測(cè)均為--SEA/--SEA缺失型，說明長(zhǎng)時(shí)間體外傳代培養(yǎng)，經(jīng)仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)的羊水細(xì)胞基因突變?cè)谖闯霈F(xiàn)交叉污染細(xì)胞的前提下，維持不變。故本課題構(gòu)建的重癥α-地貧胎兒特異性iPSCs具有類似胚胎干細(xì)胞的自我更新和多向分化能力，可作為α-地貧進(jìn)一步治療的成熟細(xì)胞模型。

綜上所述，本研究以仙臺(tái)病毒為載體，雖然沒有被整合，但安全性仍需關(guān)注。雖然本課題構(gòu)建了重型α-地貧特異性iPSCs，但今后深入探討應(yīng)集中在利用基因編輯修復(fù)iPSCs突變基因，細(xì)胞向紅系分化修復(fù)前后的iPSCs，Western blot與RT-PCR技術(shù)分析Hb A的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄情況。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? 胡俊杰，陳鑫蘋，符生苗.干細(xì)胞治療地中海貧血：現(xiàn)狀及未來[J].中國(guó)組織工程研究，2018，22（21）：3431-3437.

[2]? 嚴(yán)金梅.重型α-地中海貧血胎兒羊水來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立及鑒定[D].廣州：廣州醫(yī)科大學(xué)，2017.

[3]? 冼業(yè)星，嚴(yán)金梅，陳玉嫦，等.血紅蛋白Bart′s水腫胎兒綜合征誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系的建立[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2018， 34（7）：1123-1127，1131.

[4]? 李華暉.重型地中海貧血患者同胞造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[D].廣西：廣西醫(yī)科大學(xué)，2017.

[5]? 李繼慧，覃運(yùn)榮，梁毅.地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室分子診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].分子診斷與治療雜志，2018，10（3）：202-205.

[6]? 劉雅麗.ssODNs結(jié)合小分子化合物對(duì)β-地中海貧血病人特異iPS細(xì)胞系基因修復(fù)的研究[D].廣州：廣州醫(yī)科大學(xué)，2017.

[7]? 黃利華，劉冬霞，李偉明，等.廣東省清遠(yuǎn)地區(qū)人群α-地中海貧血基因型及臨床表型特點(diǎn)[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39（6）：584-588.

[8]? 唐燕青，陳秋莉，陳碧艷，等.15969例輕型α地中海貧血的基因型和血液學(xué)分析[J].中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2017，25（1）：57-60.

[9]? 賀鈺磊，徐鳴，謝雅梅，等.四川地區(qū)α地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果及分布特征分析[J].四川醫(yī)學(xué)，2017，38（11）：1304-1306.

[10]? 李哲濤，李伍高，唐永梅，等.東南亞缺失型α地中海貧血的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017， 33（12）：2006-2008.

[11]? 羅茗月，肖克林，邵聰文，等.α地中海貧血不同基因型攜帶（患）者紅細(xì)胞參數(shù)的差異性研究[J].中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志，2017，25（7）：474-478.

[12]? 林芬，楊立業(yè)，林敏，等.華南人群地中海貧血的罕見基因突變[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2017，34（6）：792-796.

[13]? 李榮，鄧明芬，徐艷文，等.應(yīng)用全基因組擴(kuò)增技術(shù)對(duì)α地中海貧血進(jìn)行植入前遺傳學(xué)診斷的效果分析[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2018，27（2）：166-170.

[14]? 孕婦七項(xiàng)血液指標(biāo)在東南亞型α-地中海貧血診斷、篩查中的價(jià)值分析[J].現(xiàn)代診斷與治療，2017，28（2）：166-170.

[15]? 杜麗，王繼成，秦丹卿，等.HKαα地中海貧血的基因診斷及臨床表型分析[J].中國(guó)產(chǎn)前診斷雜志：電子版，2017， 9（3）：20-22.

[16]? Kwon EM，Connelly JP，Hansen NF，et al. iPSCs and fibroblast subclones from the same fibroblast population contain comparable levels of sequence variations [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2017，114（8）：1964-1969.

[17]? He S，Qin Q，Huang P，et al. Characterization of a Large Novel α-Globin Gene Cluster Deletion Causing α0-Thalassemia in a Chinese Family [J]. Hemoglobin，2017，41（4-6）：297-299.

[18]? Para S，Mungkalasut P，Chanda M，et al. An Observational Study of the Effect of Hemoglobinopathy，Alpha Thalassemia and Hemoglobin E on P.Vivax Parasitemia [J]. Mediterr J Hematol Infect Dis，2018，10（1）：e2018015.

[19]? de Azevedo LA，Bonazzoni J，Wagner SC，et al. Do Alpha Thalassemia，F(xiàn)etal Hemoglobin，and the UGT1A1 Polymorphism have an Influence on Serum Bilirubin Levels and Cholelithiasis in Patients with Sickle Cell Disease？ [J]. Mol Diagn Ther，2017，21（4）：437-442.

[20]? Hsu SY，Chen SH，F(xiàn)u RH. Alpha-thalassemia major and restrictive foramen ovale in a preterm neonate without severe hydrops fetalis [J]. Pediatr Neonatol，2017，58（6）：546-548.

[21]? Nguyen LS，Redheuil A，Mangin O，et al. Sickle-cell and alpha-thalassemia traits resulting in non-atherosclerotic myocardial infarction：Beyond coincidence？ [J]. World J Clin Cases，2017，5（12）：428-431.

（收稿日期：2019-03-07? 本文編輯：任? ?念）