李先磊 呂點點

摘要 ? ?本文對乳酸桿菌（HnL-3）和枯草芽孢桿菌（HnB-4）進行了單獨培養(yǎng)和聯(lián)合培養(yǎng)。結(jié)果表明，將HnL-3與HnB-4優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行聯(lián)合培養(yǎng)24 h后得到的菌濃度為4.8×109個/mL，與單獨培養(yǎng)時菌液濃度差異不顯著。因此，可將2種菌聯(lián)合培養(yǎng)用于改善動物腸道微環(huán)境。

關(guān)鍵詞 ? ?乳酸桿菌;芽孢桿菌;聯(lián)合培養(yǎng);菌液濃度

中圖分類號 ? ?Q935 ? ? ? ? 文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）18-0165-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

Abstract ? ?The individual and combined culture of Lactobacillus（HnL-3）and Bacillus subtilis（HnB-4）were studied.The results showed that the concentration of bacterium was 4.8×109/mL after 24 h combined culture of HnL-3 and HnB-4 in optimized medium，and there was no significant difference in the concentration of bacterium between combined and individual culture.Therefore，two kinds of bacteria can be combined cultured to improve the intestinal microenvironment of animals.

Key words ? ?Lactobacillus;Bacillus subtilis;combined culture;bacterial concentration

我國畜牧業(yè)發(fā)展對經(jīng)濟水平和國民生活質(zhì)量的提高起到了極大的作用。據(jù)統(tǒng)計，我國肉類總產(chǎn)量在1998年躍居世界第一位，肉和蛋的人均占有量超過世界平均水平[1]。同時，在短時間內(nèi)我國的配合飼料產(chǎn)量大幅增加，一躍成為世界第二飼料工業(yè)國。因此，人們對畜產(chǎn)品的關(guān)注點從數(shù)量變?yōu)橘|(zhì)量。

動物微生態(tài)制劑是對人、動物等有益的生物制劑或活菌制劑。常見的微生態(tài)制劑生產(chǎn)菌種包括芽孢桿菌類、乳酸桿菌類、酵母菌類等。乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌已經(jīng)廣泛應(yīng)用在微生態(tài)制劑生產(chǎn)中，但聯(lián)合使用較為少見，如二者聯(lián)合培養(yǎng)與單獨使用并無區(qū)別，則聯(lián)合培養(yǎng)用于動物微生態(tài)制劑的研制，將能更好地改善動物腸道微生態(tài)環(huán)境，為提高畜產(chǎn)品的質(zhì)量作出貢獻。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

1.1.1 ? ?菌株。乳酸桿菌（HnL-3）、枯草芽孢桿菌（HnB-4），均為湖南理工學院化學化工學院保存菌株。

1.1.2 ? ?培養(yǎng)基[2-3]。①MRS培養(yǎng)基。將胰蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸二胺2 g、吐溫-80 1 g、磷酸氫二鉀0.4 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g分別溶解于1 000 mL水中調(diào)節(jié)pH值至6.3，113 ℃蒸汽滅菌 30 min。MRS-HG中葡萄糖換成水解糖20 g。②枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基。將胰蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、氯化鈉10 g分別溶于1 000 mL水后調(diào)節(jié)pH值至7.2，于121 ℃蒸汽滅菌20 min。LB-C培養(yǎng)基將胰蛋白胨換成玉米漿50 g。③混合培養(yǎng)基（MRS-LB*）。將玉米漿50 g、牛肉膏10 g、酵母浸出物5 g、水解糖20 g、氯化鈉10 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸二胺2 g、吐溫-80 1 g、磷酸氫二鉀0.4 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g溶解于1 000 mL水中，調(diào)節(jié)pH值至6.5，113 ℃滅菌30 min。

1.1.3 ? ?主要儀器。電子天平（JY3002、BSM320）、雙目顯微鏡（BM2000）、超凈工作臺（SW-CJ-2D）、恒溫培養(yǎng)箱（ZHWY-2102）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9076A）、超低溫冰箱（U-410）、血細胞計數(shù)板等。主要化學藥品均使用分析純。

1.2 ? ?試驗方法

1.2.1 ? ?菌株的活化。將實驗室冷凍干燥保存的HnL-3菌粉與HnB-4菌粉（原菌液濃度1.0×109個/mL）1 g用0.85%無菌生理鹽水溶解。溶解后分別轉(zhuǎn)入100 mL MRS和LB液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)48 h，將菌液調(diào)至濃度為1.0×108個/mL[4]。

1.2.2 ? ?菌株的單獨培養(yǎng)。將活化后的乳酸桿菌（菌液濃度1.0×108個/mL）1 mL分別接種到MRS和MRS-HG培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用血細胞計數(shù)板檢測菌液濃度。將活化后的枯草芽孢桿菌（菌液濃度1.0×108個/mL）1 mL分別接種到LB和LB-C培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用血細胞計數(shù)板檢測菌液濃度[4]。

1.2.3 ? ?菌株的聯(lián)合培養(yǎng)及計數(shù)。將活化后的乳酸桿菌與枯草芽孢桿菌（菌液濃度1.0×108個/mL）各1 mL接種到聯(lián)合培養(yǎng)基MRS-LB*中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用血細胞計數(shù)板檢測菌液濃度。

1.2.4 ? ?對比培養(yǎng)結(jié)果。試驗結(jié)束后，將不同培養(yǎng)基條件下菌液濃度進行差異分析，評價不同培養(yǎng)基之間的區(qū)別。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?乳酸桿菌培養(yǎng)結(jié)果

活化之后的乳酸桿菌經(jīng)過培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如表1所示。可以看出，用MRS與MRS-HG培養(yǎng)基對乳酸桿菌進行培養(yǎng)時，乳酸桿菌均能正常生長，培養(yǎng)24 h后菌液濃度無明顯差異。

2.2 ? ?枯草芽孢桿菌培養(yǎng)結(jié)果

活化之后的乳酸桿菌經(jīng)過培養(yǎng)，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，用 LB與LB-C培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌進行培養(yǎng)時，枯草芽孢桿菌均能正常生長，培養(yǎng)24 h后菌液濃度亦無明顯差異。

2.3 ? ?聯(lián)合培養(yǎng)結(jié)果

將乳酸桿菌與枯草芽孢桿菌進行聯(lián)合培養(yǎng)，培養(yǎng)后平均菌液濃度為4.86×109個/mL?？梢钥闯?，用改良后的培養(yǎng)基聯(lián)合培養(yǎng)乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌時，2株微生物均能正常生長，且培養(yǎng)24 h后總菌液濃度較分開培養(yǎng)時菌液濃度有所提高。

3 ? ?結(jié)論與討論

乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌單獨培養(yǎng)時采用同樣的培養(yǎng)條件，接種濃度和接種量一致，培養(yǎng)后菌液測定采用同型號血細胞計數(shù)板和顯微鏡。而混合培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為改良后的培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件不變。試驗結(jié)果顯示，單獨培養(yǎng)時MRS-HG和LB-C 2種培養(yǎng)基與MRS和LB 2種培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸桿菌和枯草芽孢桿菌無顯著差異，可以替代2株菌的單獨培養(yǎng)。聯(lián)合培養(yǎng)結(jié)果說明2株微生物可以在MRS-LB*培養(yǎng)基中正常生長且菌液濃度有一定提高[5-6]。該結(jié)果為飼喂試驗動物和條件控制提供了幫助，也為更好地制備微生態(tài)制劑打下了基礎(chǔ)[7-8]。

在進行菌株活化時，應(yīng)采用生理鹽水或適合微生物生長的培養(yǎng)基進行活化。本試驗采用生理鹽水，是考慮到之后的培養(yǎng)會使用不同培養(yǎng)基進行菌液濃度檢測，避免活化時帶來的影響。

混合培養(yǎng)時采用的pH值為乳酸桿菌適宜的pH值，主要原因是枯草芽孢桿菌適用pH值范圍較乳酸桿菌廣，而且枯草芽孢桿菌環(huán)境適應(yīng)能力較強，可以在pH值6.3時正常生長。

4 ? ?參考文獻

[1] 何明清.我國動物微生態(tài)制劑的起源、發(fā)展戰(zhàn)略及應(yīng)用前景[J].中國微生態(tài)學雜志，2001，13（3）：166-167.

[2] 劉鴿，劉絨歡，劉升蘭，等.雞腸道內(nèi)乳酸菌的分離鑒定及體外抑菌試驗[J].中國動物檢疫，2017，34（1）：86-89

[3] 劉宇，尹珺伊，江波濤，等.一株驢源干酪乳桿菌分離、鑒定及生物學特性研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2017，29（6）：16-19.

[4] 鐘日聰，劉影，徐春厚.三株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)胞外代謝產(chǎn)物的活性與成分分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2017，56（5）：915-918.

[5] 李研東，韓雪，王穎，等.動物微生態(tài)制劑的研究進展[J].飼料研究，2008（2）：22-24.

[6] 孔海英，孟憲梅.動物微生態(tài)制劑的研究進展及發(fā)展應(yīng)用前景[J].吉林糧食高等?？茖W校學報，2006（1）：4-7.

[7] 梁東梅，李玉鵬，杜艷芬，等.三株乳酸桿菌的分離鑒定與益生特性研究[J].中國飼料，2018（11）：24-29.

[8] 胡瑞萍，丁賢，李來好，等.響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌NHS1產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)[J].生態(tài)學雜志，2018，37（2）：605-612.