李 奧，劉麗麗，張克強(qiáng)，杜連柱，齊利格娃，丁文濤，高文萱

(1.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所,天津 300191；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；3.北京化工大學(xué)，北京 100029)

能源與環(huán)境是當(dāng)今人類面臨的兩大問題。將農(nóng)業(yè)廢棄物用于沼氣發(fā)酵對于改善農(nóng)村環(huán)境、緩解能源消耗具有重要意義。目前的沼氣工程主要以畜禽糞便為原料，而畜禽糞便的大量消耗以及養(yǎng)殖數(shù)量的波動使得畜禽糞便供應(yīng)不足的問題日益突出[1]。將農(nóng)作物秸稈與畜禽糞便混合進(jìn)行厭氧發(fā)酵制沼氣，不僅能改善農(nóng)村環(huán)境實現(xiàn)秸稈資源化利用，更能夠減少畜禽糞便的消耗，提高沼氣工程運行的持續(xù)性和穩(wěn)定性[2]。此外混合秸稈發(fā)酵還可以改善單一原料進(jìn)行厭氧發(fā)酵消化效率不高的問題，提高厭氧發(fā)酵的消化效果[3-5]。由此可見將農(nóng)作物秸稈與畜禽糞便混合厭氧發(fā)酵制沼氣，是解決當(dāng)前沼氣生產(chǎn)原料問題的首要途徑[6]。而干發(fā)酵的含水率低，處理后的殘留物可做堆肥使用，不會造成水體污染；發(fā)酵過程中容積產(chǎn)氣量高，因此采用厭氧干發(fā)酵的方式制沼氣符合環(huán)保、節(jié)約型社會發(fā)展的要求。

為了獲得較佳的產(chǎn)氣性能，劉戰(zhàn)廣[7]等研究表明，調(diào)節(jié)糞草比并不能提高原料的產(chǎn)氣潛能，但在營養(yǎng)調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)改良方面有一定促進(jìn)作用。同時有研究表明接種物的來源、富集培養(yǎng)方式及添加比例對厭氧發(fā)酵影響很大，一般認(rèn)為接種物添加量為發(fā)酵料液的 10 %～15%，既可實現(xiàn)正常啟動其運行也比較穩(wěn)定[8]。對于干發(fā)酵來講,由于含固量(Total solid,TS)比較高(一般在 17%以上)[9]，若接種量不足，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量相對較少，容易造成VFA積累，出現(xiàn)“酸中毒”，需要重新調(diào)節(jié)，給生產(chǎn)帶來不便。孫國朝[10]等研究發(fā)現(xiàn)，加大接種量，是防止前期酸化、縮短干發(fā)酵啟動時間的關(guān)鍵措施[6]。馬傳杰[11]等人研究發(fā)現(xiàn)若接種量較大,可以實現(xiàn)快速啟動，但會占據(jù)較多池容積，造成消化池容積利用率低。房明[12]等研究了接種比對餐廚垃圾中溫厭氧消化的影響，結(jié)果表明，隨著接種比逐漸提高(1∶1～4∶1)，餐廚垃圾的發(fā)酵延滯期逐漸縮短。李文哲[13]等在不同接種量對稻稈厭氧發(fā)酵特性研究中發(fā)現(xiàn)，適量的接種物可以提高消化系統(tǒng)的緩沖能力，有利于產(chǎn)氣高峰提前。由此可見，明確不同接種量對厭氧發(fā)酵的影響，進(jìn)而實現(xiàn)厭氧發(fā)酵條件的科學(xué)控制，對于促進(jìn)厭氧發(fā)酵工程實踐具有重要意義。本試驗選取常見的農(nóng)業(yè)廢棄物豬糞和水稻秸稈為底物，研究豬糞與秸稈在不同VS質(zhì)量比條件下混合產(chǎn)沼氣的特性，探索不同接種量對豬糞秸稈厭氧干發(fā)酵的影響，為厭氧干發(fā)酵的科學(xué)運行與管理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 底物與接種物

豬糞和秸稈均取自天津市西青區(qū)益利來養(yǎng)殖有限公司，豬糞為養(yǎng)殖場日產(chǎn)鮮豬糞，取回后儲存于4℃±1℃的冰箱，秸稈風(fēng)干后粉碎至0.5～1.0 cm，并存放于干燥陰涼處。接種物取自實驗室正常運行的中溫混合厭氧反應(yīng)器(continuous stirred tank reactor，CSTR)。活性污泥取出后4000 r·min-1離心 20 min，去上清液后留沉淀物(接種物)備用。并將接種物在室溫下活化微生物3天后使用。上清液用于調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的總固體含量(TS)到20%。底物與接種物的理化指標(biāo)見表1。

表1 底物和接種物的化學(xué)組分

1.2 試驗裝置

采用氣袋法進(jìn)行厭氧批式試驗，具體方法如下：采用有效容積為500 mL的厭氧瓶作為厭氧發(fā)酵裝置(見圖1)。瓶口頂部為丁基橡膠塞，并在橡膠塞中部打孔以連接氣袋搜集氣體，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的沼氣收集于3 L鋁制集氣袋中。

圖1 發(fā)酵裝置結(jié)構(gòu)圖

1.3 試驗設(shè)計

試驗方案設(shè)計如表2所示。豬糞與秸稈的比例(VS質(zhì)量比)選擇1∶1和2∶1；接種量為接種物占底物(豬糞+秸稈)的VS質(zhì)量比(30%，40%，50%)。物料TS濃度為20%。每種發(fā)酵方式有3組平行，每個發(fā)酵瓶中有機(jī)負(fù)荷為110 gVS·L-1,裝有物料總質(zhì)量為250 g。發(fā)酵原料(見表2)添加完畢后，向厭氧發(fā)酵瓶中沖入氮氣，持續(xù)2 min，以排盡厭氧瓶頂部空間中的空氣，保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境。然后在厭氧瓶頂部塞上丁基橡膠塞，加蓋擰緊并在塞口用橡皮管連接氣袋。將各厭氧瓶于37℃±1℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每天下午2點取下氣袋，用氣筒抽取測量產(chǎn)氣體積，并定期用2 mL注射器采集氣體樣品，用于CH4和CO2含量測定。

表2 各處理組原料、接種物加入量

1.4 分析方法

沼氣產(chǎn)量使用氣袋進(jìn)行搜集，并用氣筒抽取進(jìn)行測定；總固體含量(TS)、揮發(fā)性固體含量(VS)采用標(biāo)準(zhǔn)方法測定[14]；將所取發(fā)酵樣品用蒸餾水稀釋10倍測量pH值；甲烷百分含量通過氣相色譜儀測定(Trace1300，Thermo，美國)，色譜柱采用2 m×φ3 mm的Porapak Q 柱，檢測器為熱導(dǎo)檢測器(TCD)，采用高純氦氣作為載氣，測定條件為：載氣流速8 mL·min-1，柱溫40℃，檢測器溫度200℃，進(jìn)樣口溫度120℃；樣品稀釋后用稀硫酸調(diào)節(jié)pH值<3.0，離心(10000 rpm，25℃條件下離心10 min)，過濾(0.45 μm有機(jī)濾膜)濾液經(jīng)丙酮稀釋后采用氣相色譜儀(Thermotrace1300)測定揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)，M 12毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm×1 μm)；進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測器溫度為220℃，載氣流速8 mL·min-1。根據(jù)胡榮篤[15]的計算方法，將發(fā)酵液中各種脂肪酸的濃度換算成乙酸的濃度來計算分析。

DNA采用Fast DNAs Spin Kit (Mpbio，美國)試劑盒提取，發(fā)酵前后各處理的3個重復(fù)分別提取DNA，通過超微量分光光度計(Nano Drop 2000，Thermo Scientific，Wilmington，美國)測定濃度，然后分別將各處理3個重復(fù)提取的DNA混勻，樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行微生物分類測序，測序類群為細(xì)菌和古菌，測序平臺為MiseqTM,測序長度為2×300bp，擴(kuò)增區(qū)域均為 V3-V4,采用巢式PCR；細(xì)菌測序引物為341F，(序列F：CCTACGGGNGGCWGCAG)；805R，(序列R：GACTACHVGGGTATCTAATCC)；古菌測序引物為340F，(序列F：CCCTAYGGGGYGCASCAG)；1000R，(序列R：GGCCATGCACYWCYTCTC)。測序后的 DNA 序列進(jìn)行拼接，通過 barcode 標(biāo)簽序列區(qū)分樣品序列，采用 Prinseq(0.20.4)對樣本序列做質(zhì)量控制，在 QIIME 中調(diào)用Uclust(1.1.579)軟件，設(shè)置 97%相似性，對有效 DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(OTU)分類，采用 RDP軟件比對 Silva 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類，在門、綱、目、科和屬分類水平上統(tǒng)計樣本的物種豐度。采用 Mothur軟件計算種群豐富度指數(shù)(Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù))和群落多樣性指數(shù)(Shannon 指數(shù)和 Simpson 指數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原料比例與接種量下干發(fā)酵產(chǎn)氣特性

各處理組日產(chǎn)氣量和甲烷體積分?jǐn)?shù)如圖2和圖3所示，各試驗組在發(fā)酵前期和后期各出現(xiàn)一個產(chǎn)氣高峰。豬糞∶秸稈為1∶1，接種量為50%的試驗組(PH-1)在第7天最先達(dá)到產(chǎn)氣高峰，產(chǎn)量為233.33 mL，甲烷體積分?jǐn)?shù)為32.66%，隨后迅速下降；第2個產(chǎn)氣高峰在第31天出現(xiàn)，產(chǎn)量為228.33 mL，甲烷體積分?jǐn)?shù)為62.46%。PH-1發(fā)酵啟動速度明顯要快于其它試驗組，表明在此比例下厭氧發(fā)酵過程中加大接種量有利于加快產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)。接種量為30%的試驗組(PL-1)在第17天達(dá)到第1個產(chǎn)氣高峰，40%接種量的試驗組(PM-1)在第16天達(dá)到第1個產(chǎn)氣高峰，產(chǎn)氣量分別為231.67 mL和176.67 mL，甲烷體積分?jǐn)?shù)分別為51.88%和39%。豬糞∶秸稈為2∶1，接種量為50%的試驗組(PH-2)在第14天達(dá)到第一個產(chǎn)氣高峰，產(chǎn)氣量213.33 mL，甲烷體積分?jǐn)?shù)為55%；接種量為30%(PL-2)與40%(PM-2)的試驗組分別在第18天和第12天達(dá)到產(chǎn)氣高峰，產(chǎn)氣量分別191.66 mL和211.67 mL，甲烷體積分?jǐn)?shù)分別為57%和41%；在此比例下產(chǎn)氣高峰時間與產(chǎn)氣量相差不大，說明接種量對其產(chǎn)氣性能影響不大。

圖2 各處理組沼氣日產(chǎn)量變化曲線

圖3 各處理組甲烷體積分?jǐn)?shù)變化曲線

累積VS甲烷產(chǎn)率如圖4所示。豬糞∶秸稈為1∶1和2∶1時累積產(chǎn)氣量趨勢大致相同，產(chǎn)氣速率均為前期緩慢，后期加快，最終處于平緩狀態(tài)，累積甲烷產(chǎn)氣率均為接種量50%的試驗組最高，累積沼氣產(chǎn)量分別為6801.67 mL和6038.33 mL，累積VS甲烷產(chǎn)率分別達(dá)到127.07 mL·g-1VS，116.91 mL·g-1VS。同種接種量、不同原料比例下累積VS甲烷產(chǎn)率均為1∶1高于2∶1。

圖4 各處理組累積VS甲烷產(chǎn)率的變化曲線

2.2 不同原料比例及接種量對TS、VS降解率的影響

發(fā)酵原料的TS，VS降解率是衡量厭氧消化性能的重要指標(biāo)[9]。不同試驗組TS，VS降解率(見圖5)采用發(fā)酵前后總TS，VS量計算。不同試驗組VS降解率為29% ～46%，TS降解率為12%～29%。豬糞∶秸稈為2∶1接種量為40%(PM-2)降解率較高，TS降解率為46%，VS降解率為29%，顯著高于其他處理組，其余處理組并無顯著性差異(p>0.05)。

圖5 不同配比及接種量TS，VS下發(fā)酵降解率

2.3 微生物群落多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析

提取發(fā)酵前后樣品總DNA，采用宏基因組測序的方法分析細(xì)菌、古菌群落結(jié)構(gòu)。在相似度97%的條件下利用mothur做rarefaction 分析得知發(fā)酵前后各處理細(xì)菌和古菌Shannon指數(shù)稀釋曲線隨著序列數(shù)增加而快速趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)合理，可以反應(yīng)樣品的Alpha多樣性[16]。

對樣本進(jìn)行細(xì)菌Alpha多樣性分析，結(jié)果如表3所示。Coverage指數(shù)值反映測試結(jié)果的真實情況，各樣本Coverage值均大于0.99，說明能很好的反映測試結(jié)果。比較各組處理后多樣性指數(shù)，發(fā)現(xiàn)Shannon,Simpson,ACE和Chao1指數(shù)均相差不大，說明各處理發(fā)酵后細(xì)菌群落多樣性基本一致，原料配比和接種量對發(fā)酵后細(xì)菌多樣性無顯著影響。

表3 發(fā)酵過程中細(xì)菌的豐富度和多樣性變化

發(fā)酵前后各處理組古菌豐富度及多樣性變化見表4。各處理古菌OTU數(shù)量顯著低于細(xì)菌，且發(fā)酵前后OTU數(shù)量變化趨勢隨接種量的不同而差異。30%和40%接種量處理(PL-1,PM-1,PL-2和PM-2)使得發(fā)酵后OTU數(shù)量和Chao1指數(shù)增加，而50%接種量處理(PH-1和PH-2)使得發(fā)酵后OTU數(shù)量和Chao1指數(shù)降低，說明30%和40%接種量處理增加了古菌豐富度，而50%接種量降低了古菌豐富度。究其原因，各處理發(fā)酵后OTU數(shù)量相差不大，而50%接種量發(fā)酵前OTU數(shù)量高于30%和40%接種量，這些增加的OTU隨著干發(fā)酵的進(jìn)行而被競爭消失，所以呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。發(fā)酵后接種量為30%的試驗組(PL-1和PL-2)Shannon指數(shù)明顯低于接種量為40%(PM-1和PM-2)和50%(PH-1和PH-2)的試驗組，且接種量為40%的試驗組(PM-1和PM-2)Shannon指數(shù)最高，說明在一定范圍內(nèi)隨著接種量的增加古菌群落多樣性也隨之增加；而相同接種量不同原料比下Shannon指數(shù)相差不大，說明不同原料比對古菌群落多樣性的影響不大。接種量為30%的試驗組(PL-1和PL-2)Simpson指數(shù)最大，而同種接種量不同原料比下各處理Simpson指數(shù)相近，表明在一定范圍內(nèi)隨接種量的增加古菌優(yōu)勢菌群的生物量占總生物量的比例在增加；而不同原料比例對優(yōu)勢古菌基本沒有影響。

表4 發(fā)酵過程中古菌的豐富度和多樣性變化

2.3.2 菌群結(jié)構(gòu)分析

圖6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化(屬水平)

本研究發(fā)酵前后古菌群落結(jié)構(gòu)變化見圖7。Methanobrevibacter、Methanoculleus和Methanomassiliicoccus為優(yōu)勢古菌，豐度分別為15.1%～45.84%,39.35%～61.97和13.99%～42.21%，且Methanoculleus為發(fā)酵后新增優(yōu)勢菌群。另一種優(yōu)勢菌群Methanosarcina是已知的唯一能夠利用所有產(chǎn)甲烷途徑的菌屬，可利用甲基類化合物生長，有的也利用乙酸，H2/CO2，CO甚至丙酮酸鹽[20]。其抗逆性較強(qiáng)，可高效利用有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為甲烷[21]，其發(fā)酵后的豐度明顯升高，發(fā)酵前菌群豐度為0.07%～0.65%，而發(fā)酵后菌群豐度為2.91%～14.30。Methanoculleus和Methanosphaerula均是氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[22]，Methanosphaerula發(fā)酵前豐度在6.94%～24.06%，發(fā)酵后豐度降為3.44%～9.3%。接種量與古菌群落結(jié)構(gòu)存在相關(guān)性，在兩種原料配比下Methanomassiliicoccus均在接種量為40%的處理組中豐度最高，而Methanosphaerula均在接種量為50%的處理組中豐度最高。原料配比的改變未觀察到對古菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，說明古菌群落結(jié)構(gòu)對接種量較敏感而對原料配比不敏感。

圖7 古菌群落結(jié)構(gòu)變化(屬水平)

發(fā)酵前后細(xì)菌(屬水平)主成分分析如圖8和圖9所示。發(fā)酵前環(huán)境因子TS、pH值與優(yōu)勢菌屬Pseudomonas,Clostridiumsensustricto呈正相關(guān)；菌群Terrisporobacter，Streptococcus以及Lactobacillus的生長與VFA有密切的相關(guān)性，在發(fā)酵后受VFA降低的影響，菌群Terrisporobacter，Streptococcus以及Lactobacillus的豐度也隨之降低。且隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)現(xiàn)嗜蛋白質(zhì)菌屬Proteiniphilum與密螺旋體Treponema菌群的豐度大量增加。在主分類軸PCA1(解釋75.8%差異)上，兩種比例各試驗組分布均較遠(yuǎn)，且在豬糞∶秸稈為2∶1比例下隨著接種量的提高，各樣品在PCA1上從左至右依次分布，在PCA2(解釋8.9%差異)上從下至上依次分布，說明在此比例下接種量成為影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。

圖8 發(fā)酵前細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

圖9 發(fā)酵后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

發(fā)酵前后古菌(屬水平)群落主成分分析如圖10和圖11所示。發(fā)酵前環(huán)境因子TS、VFAs與優(yōu)勢菌屬Methanomassiliicoccus呈正相關(guān)，與Methanobrevibacter、Methanosphaerula呈負(fù)相關(guān)。環(huán)境因子pH對優(yōu)勢菌群Methanobrevibacter和Methanosphaerula有密切影響，TS對菌群Methanomassiliicoccus影響較大。發(fā)酵前豬糞∶秸稈為1∶1的試驗組隨接種量的升高，各樣品在主分類軸PCA1(解釋92.6%上的差異)上從右至左依次分布，說明接種量成為影響古菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。而發(fā)酵前PL-2和PM-2在PCA1軸上分布較近，發(fā)酵后在PCA1軸上分布較遠(yuǎn)，說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行接種量對古菌群落結(jié)構(gòu)影響逐漸增加。

圖10 發(fā)酵前古菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

圖11 發(fā)酵后古菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析

3 討論

接種物的質(zhì)量對于厭氧消化中產(chǎn)甲烷階段的運行效果和穩(wěn)定性很重要，如果接種量偏少，產(chǎn)甲烷數(shù)量相對較少，容易造成“酸中毒”；若接種量較大雖可實現(xiàn)快速啟動，在保證高處理效率的條件下，反應(yīng)器的容積必然增大。而劉戰(zhàn)廣[7]等的研究表明，調(diào)節(jié)糞草比例雖不能提高原料的產(chǎn)氣潛能，但在營養(yǎng)調(diào)節(jié)和結(jié)構(gòu)改良方面有一定促進(jìn)作用。因此，選擇合適的原料比例和接種量對厭氧干發(fā)酵的運行有重要的意義。

本文研究結(jié)果顯示，豬糞∶秸稈為1∶1和2∶1累積甲烷產(chǎn)氣量均為接種量50%的試驗組最高，說明接種物的增加有利于提高產(chǎn)氣量；而相同接種量下甲烷累積產(chǎn)量均為1∶1高于2∶1?？赡芤驗?∶1試驗組中豬糞含量較高，而豬糞主要由蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等易降解的組分組成[23],在發(fā)酵過程中容易發(fā)生揮發(fā)性脂肪酸的積累，抑制產(chǎn)甲烷菌的活性。豬糞∶秸稈為1∶1試驗組隨接種量增加，累積甲烷產(chǎn)量也隨之增加，這一結(jié)果與李文哲[13]等對不同接種量對稻稈厭氧發(fā)酵特性的影響的試驗結(jié)果一致；而豬糞∶秸稈為2∶1試驗組累積甲烷產(chǎn)氣量隨接種量的增加呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，這與李鐵[24]等研究結(jié)果一致，說明菌種對于沼氣產(chǎn)量的增加作用在一定比例下不明顯，當(dāng)菌種量增加到一定程度后才對沼氣產(chǎn)量有明顯的促進(jìn)作用?？傮w來看，相同接種量下豬糞∶秸稈為1∶1產(chǎn)氣量均高于2∶1試驗組，且在1∶1的比例下，隨接種量的增加其累積VS甲烷產(chǎn)氣量也隨之增加，因此，豬糞∶秸稈為1∶1,接種量為50%時達(dá)到最佳發(fā)酵效果。

屬水平上的細(xì)菌群落種類豐富，梭菌屬(Clostridium，梭菌目，厚壁菌門)為優(yōu)勢菌群，包括Clostridiumsensustricto和Terrisporobacter，這一結(jié)果與孔德望[25]等在豬糞厭氧發(fā)酵消化液回流體系微生物群落結(jié)構(gòu)特征與產(chǎn)氣關(guān)系研究中的研究結(jié)果一致。各處理組發(fā)酵后Simpson指數(shù)值變化規(guī)律一致均有所減少，表明經(jīng)過發(fā)酵細(xì)菌優(yōu)勢菌群的生物量占總生物量的比例在增加。本研究中古菌在屬水平上有7個主分類，其中Methanobrevibacter,Methanoculleus和Methanomassiliicoccus為優(yōu)勢古菌。在相同接種量不同原料比例下，細(xì)菌、古菌群落結(jié)構(gòu)均較相近，說明在實驗條件下豬糞∶秸稈為1∶1或2∶1對干發(fā)酵微生物的群落結(jié)構(gòu)影響不大，這與Dennehy[26]等研究結(jié)果一致。相同原料配比下不同接種量對細(xì)菌的多樣性和優(yōu)勢菌群豐度無明顯影響，其原因可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，反應(yīng)底物基質(zhì)濃度不斷降低阻礙了細(xì)菌的生長。但對于古菌，在一定范圍內(nèi)接種量的增加有利于古菌多樣性和優(yōu)勢古菌豐度的提高。

4 結(jié)論

采用批式發(fā)酵試驗，研究豬糞與秸稈在不同比例下(1∶1；2∶1，VS質(zhì)量比)接種量分別為發(fā)酵底物30%，40%，50%(VS質(zhì)量比)6個處理對厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣特性以及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，得到結(jié)論如下：

(1)相同接種量下豬糞：秸稈為1∶1產(chǎn)氣量均高于2∶1試驗組；在相同原料比例下，接種量的提高有利于產(chǎn)氣高峰的提前以及VS產(chǎn)氣量的增加；豬糞∶秸稈為1∶1,接種量為50%時達(dá)到最佳發(fā)酵效果。

(2)本研究厭氧發(fā)酵微生物中，優(yōu)勢細(xì)菌為梭菌屬(Clostridium)，包括Clostridiumsensustricto和Terrisporobacter；優(yōu)勢古菌為Methanobrevibacter,Methanoculleus和Methanomassiliicoccus，其中Methanoculleus為發(fā)酵后新增優(yōu)勢古菌。

(3)不同原料比例對細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性影響較小，但古菌群落結(jié)構(gòu)對接種量較為敏感，古菌多樣性在一定范圍內(nèi)也隨接種量的增加而提高。