吳海超 丁 飛 趙 攀

（佳和農(nóng)牧股份有限公司，湖南長沙 410000）

目前很多規(guī)模豬場都建立了本場的動物疾病診斷實驗室。而抗體檢測方法作為一種評估豬群健康狀況的手段，以靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定、高通量、易于操作等優(yōu)點廣泛應用于臨床豬場生產(chǎn)中。相比傳統(tǒng)的動物疾病診斷方法，抗體檢測有其巨大的優(yōu)勢，但是對于血清樣本的質(zhì)量要求相對較高，因為血清樣品的質(zhì)量可直接影響抗體檢測結果的準確性。

為調(diào)查不合格血清樣品質(zhì)量對抗體檢測結果的影響，同時也為了確保抗體檢測結果的準確性，特設計開展本試驗，旨在為規(guī)范豬場送檢合格的血清樣品提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器與設備

酶標儀，美國Thermo公司；不同量程移液器，德國Eppendorf公司；離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 檢測試劑盒

豬瘟病毒抗體試劑盒（批號：M101）、豬藍耳病抗體試劑盒（批號：M211）、豬偽狂病野毒抗體試劑盒（批號：EP435）購自于美國IDEXX公司，由長沙達可思生物科技有限公司提供。

1.3 樣品來源

某豬場采集的新鮮血液，樣品包括懷孕母豬、后備母豬、保育豬（46日齡）、育肥豬（142日齡）不同階段豬群血清。

2 方法

2.1 樣品制備

豬場采集不同階段豬群血液各5份，共20份，將采集的每份新鮮血液制備成標準、未分離、輕度溶血和重度溶血4種血清樣品狀態(tài)，具體如下圖（圖1、圖2、圖3、圖4）。

圖1 標準血清

圖2 未分離血清

圖3 輕度溶血

圖4 重度溶血

2.2 樣品分組

根據(jù)制備的4種血清狀態(tài)對其進行分組，將標準血清、未分離血清、輕度溶血和重度溶血血清分別分為A、B、C、D 4組。

2.3 抗體檢測

分組之后，嚴格按照豬瘟、藍耳病、偽狂犬病野毒抗體試劑盒操作說明書對4組血清樣品進行檢測，并保證檢測時溫度的穩(wěn)定性和操作條件的統(tǒng)一。

2.4 結果分析

根據(jù)各項抗體試劑盒檢測得到的OD值分別計算4組血清樣品的豬瘟抗體阻斷率、藍耳病抗體S/P值和偽狂犬病野毒抗體S/N值，以A組標準血清組檢測結果為參考值，分析B、C、D 3組血清質(zhì)量不合格組對各項抗體檢測結果的影響。

3 試驗結果

3.1 各項抗體檢測結果

通過同一批號豬瘟抗體檢測試劑盒、藍耳病抗體檢測試劑盒、偽狂犬病野毒抗體檢測試劑盒在同一室溫條件下對A、B、C、D 4組血清進行了2輪抗體檢測，通過對2輪重復試驗檢測結果進行整理，計算A、B、C、D 4組血清的豬瘟抗體平均阻斷率、藍耳病抗體S/P平均值和偽狂犬病野毒抗體S/N平均值。發(fā)現(xiàn)4組血清中豬瘟、藍耳病抗體平均值均以A組標準血清組平均值最低，而偽狂犬病野毒抗體S/N值平均值以A組最高。相比A組，B、C、D 3組質(zhì)量不合格血清組豬瘟抗體和藍耳病抗體水平普遍上升，而偽狂犬病野毒抗體水平普遍下降，具體結果見表1及圖5。由此得出，血清質(zhì)量不合格時，容易使檢測結果出現(xiàn)誤差，導致豬瘟、藍耳病及偽狂犬病野毒抗體假陽性結果的出現(xiàn)，與岳展尹[1]報道的結果一致。尤其是對于偽狂犬病野毒抗體的檢測，血清樣品質(zhì)量是否合格影響較大。

圖5 豬瘟、藍耳病及偽狂犬病野毒抗體平均值變化

3.2 群體檢測結果樣本上升與下降

表1 4組血清樣品豬瘟、藍耳病、偽狂犬病野毒抗體水平平均值變化

以A組抗體檢測結果為參考值，計算B、C、D 3組豬瘟抗體阻斷率、藍耳病抗體S/P值和偽狂犬病野毒抗體S/N值。通過對4組血清樣品抗體檢測結果進行對比分析發(fā)現(xiàn)，相比A組，B、C、D 3組大部分樣品豬瘟抗體、藍耳病抗體的檢測結果存在上升，部分樣品偽狂犬病野毒抗體檢測結果存在下降。其中豬瘟抗體和藍耳病抗體樣品檢測結果上升比例達到了65%以上，偽狂犬病野毒抗體樣本檢測結果下降比例在35%以上，具體結果見表2及圖6。

表2 4組血清樣品豬瘟、藍耳病、偽狂犬病野毒抗體檢測結果變化比例 （%）

4 討論

通過3種常規(guī)疾病抗體試劑盒對標準血清和3組質(zhì)量不合格血清樣品進行檢測，分析其結果發(fā)現(xiàn)：血清樣本質(zhì)量不合格會對抗體檢測結果造成影響，導致豬瘟抗體阻斷率、藍耳病抗體S/P值的升高和偽狂犬病野毒抗體S/N值的降低，通過升高或降低樣品的檢測值從而對整個群體的抗體水平造成影響，特別是檢測結果在判定值邊界的樣品，如豬瘟抗體阻斷率在90%和30%～40%的樣品，容易導致豬瘟抗體超陽性率和陽性率的升高，藍耳病抗體S/P值在2.5和0.4左右的樣品，同樣引起藍耳病抗體超陽性率和陽性率的升高。對于偽狂犬病野毒抗體的檢測，判定值在0.6和0.7左右時，容易導致偽狂犬野毒假陽性結果的出現(xiàn)，從而造成對整個結果的誤判。因此保證血清樣品的質(zhì)量在抗體檢測中顯得尤為重要。

血清樣品的質(zhì)量常受因紅細胞破裂發(fā)生溶血、室溫或冷藏放置時間過長和樣品反復凍融等因素的影響。血清樣品溶血主要由于紅細胞破裂導致細胞內(nèi)容物中的水、血紅蛋白（Hb）、無機鹽等物質(zhì)的釋放，血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有類似辣根過氧化物酶的作用，當血紅蛋白及其他非特異性物質(zhì)吸附至反應孔孔壁，與包被的抗原非特異性結合，在洗滌液未洗干凈時，催化底物出現(xiàn)顯色反應；還有細胞內(nèi)釋放的一些其他內(nèi)容物與包被物結合，導致血清中抗體與包被的抗原反應減少，從而減弱顯色反應[2]。因此樣品發(fā)生不同程度的溶血后均會影響抗體檢測結果的準確性。同時樣品在室溫或者冷藏環(huán)境中放置時間過長和樣品在-20℃反復凍融都會引起血清中抗原抗體的降解，也會對檢測結果造成一定的影響。因此在進行抗體檢測時，保證血清樣品的質(zhì)量很關鍵。

圖6 4組血清樣品豬瘟、藍耳病、偽狂犬病野毒抗體檢測結果上升比例

由于本次試驗選擇的質(zhì)量不合格血清樣品是由豬場采集的新鮮血液制備而成，因此樣品選擇隨機性很大，各項抗體檢測在判定值邊界的樣品較少，且檢測偽狂犬野毒抗體的血清樣品也全部呈偽狂犬野毒陰性，因此在樣品選擇上存在一定的瑕疵。但是通過本文得出的結論還是可以明顯看出血清質(zhì)量不合格對抗體檢測的影響，希望通過本研究得出的相關結果能為豬場規(guī)范送樣流程提供借鑒。