趙煒 趙志正

摘要：目的? 觀察五味子乙素對人乳腺癌細胞增殖及Notch-1信號通路的影響，探討其抑制乳腺癌發(fā)展的可能分子機制。方法? 不同濃度五味子乙素（0、20、40、80 μmol/L）處理乳腺癌細胞MCF-7，作用24、48、72 h后，CCK-8法檢測MCF-7細胞增殖。裸鼠皮下接種MCF-7細胞建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型，隨機分為對照組和五味子乙素組，每4 d測量腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線，32 d后取腫瘤稱重。Western blot檢測MCF-7細胞和腫瘤組織Notch-1及其下游分子Hes-1、Hey-1蛋白水平;免疫組化檢測小鼠腫瘤組織Notch-1的表達。結果? 與空白組比較，五味子乙素顯著抑制MCF-7細胞生長，且抑制作用具有時間和濃度依賴性，同時顯著降低MCF-7細胞Notch-1及其下游分子Hes-1、Hey-1蛋白的表達。與對照組比較，五味子乙素組裸鼠腫瘤體積及質量明顯受抑制，且腫瘤組織Notch-1及其下游分子Hes-1、Hey-1蛋白表達顯著降低。結論? 五味子乙素可抑制乳腺癌發(fā)展，其機制可能與抑制乳腺癌細胞MCF-7及其裸鼠模型移植瘤的生長、降低Notch-1信號通路相關因子表達有關。

關鍵詞：五味子乙素;細胞增殖;Notch-1;移植瘤;乳腺癌細胞MCF-7;小鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）10-0055-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.013????? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To explore the effects of schisandrin B on the growth of MCF-7 and Notch-1 signaling pathway in breast cancer; To explore possible molecular mechanism that inhibit the development of breast cancer. Methods Human breast cancer cell MCF-7 was treated with different concentrations of schisandrin B （0， 20， 40， 80 μmol/L） for 24， 48， 72 h. CCK-8 assay was used to detect cell growth. Nude mice breast cancer xenograft models were established by subcutaneous inoculation of MCF-7 cells in nude mice and were randomly divided into the control group and the schisandrin B treatment group. Tumor volume was measured every 4 days and the tumor growth curve was drawn. After 32 days， the tumor was weighed. The expressions of Notch-1， Hes-1， Hey-1 in MCF-7 cells and tumor tissues were detected by Western blot. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Notch-1 in tumor tissues. Results Compared with the blank group， schisandrin B significantly inhibited the growth of MCF-7 cells in a time- and concentration-dependent manner， and significantly decreased the expression of Notch-1 and its downstream molecules Hes-1 and Hey-1 in MCF-7 cells. Compared with the control group， the tumor volume and quality of the schisandrin B treatment group were significantly inhibited， and the expression of Notch-1 and its downstream molecules Hes-1 and Hey-1 significantly decreased. Conclusion Schisandrin B can inhibit the growth of breast cancer， and its mechanism can be related to inhibiting the growth of breast cancer cells MCF-7 and its nude mouse model， and decreasing the expression of Notch-1 signaling pathway.

Keywords： schisandrin B; cell proliferation; Notch-1; xenografted tumor ; breast cancer cell MCF-7; mice

乳腺癌是發(fā)生在女性中最常見腫瘤之一，是女性癌癥相關死亡的主要原因[1]。近年來，隨著診斷學尤其是癌癥分子生物學和基因組學領域的進步，乳腺癌檢測發(fā)生了革命性的變化[2]。目前，治療乳腺癌主要方法包括外科手術、化療、放療，大大改善了乳腺癌的預后，但仍有許多患者復發(fā)及在治療過程中出現(xiàn)不良反應和耐藥。因此，尋找有效治療乳腺癌的藥物，成為當前研究的重點。五味子乙素（Schisandrin B）是從五味子中分離得到的主要生物活性成分[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素在多種疾病中介導多種生物活性，包括抗炎、抗氧化和心血管保護作用[4-6]。有報道顯示，五味子乙素可抑制膽管癌、肺腺癌、膠質瘤、胃癌細胞增殖[7-10]，誘導細胞凋亡，減弱腫瘤的侵襲和轉移[11]。本研究分別通過細胞與動物實驗，觀察五味子乙素對人乳腺癌細胞增殖及Notch-1信號通路表達的影響，探討其可能的分子機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

SPF級雌性Balb/C小鼠10只，6～8周，體質量18～20 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。飼養(yǎng)于溫度（20±2）℃、相對濕度（50±5）%環(huán)境，日照時間12 h，自由攝食飲水。實驗前小鼠適應性喂養(yǎng)7 d。

1.2? 藥物

五味子乙素，南京道斯夫生物科技有限公司，溶于二甲基亞砜并配制成100 mmol/L貯備液保存。

1.3? 細胞

人乳腺癌細胞株MCF-7，中國科學院上海細胞庫提供，在本實驗室進行培養(yǎng)。

1.4? 主要試劑與儀器

杜爾伯科改良伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清，美國Gibco公司;青/鏈霉素，美國Sigma公司;BCA法蛋白濃度檢測試劑盒，上海碧云天生物技術公司;抗Notch-1抗體、抗Hes-1抗體、抗Hey-1抗體、抗β-actin抗體和辣根過氧化物標記的二抗，英國Abcam公司;CCK-8試劑盒，上海博谷生物科技有限公司。超低溫冰箱（日本Sanyo公司），CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），低速離心機（美國Thermo公司），電泳儀（北京六一生物科技有限公司），凝膠成像儀（美國Azure Biosystems公司）。

2? 實驗方法

2.1? 細胞培養(yǎng)

MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2且濕度完全飽和的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期取對數(shù)生長期細胞進行傳代。

2.2? CCK-8實驗

用于檢測細胞增殖并計算增殖抑制率。100 μL對數(shù)生長期MCF-7細胞（1×105/孔）接種于96孔板，每組設置4個復孔，共4組，加入終濃度為0、20、40、80 μmol/L五味子乙素，培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用分光光度計檢測波長450 nm處吸光度，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-給藥組A450÷對照組A450）×100%。

2.3? 乳腺癌細胞移植瘤裸鼠模型建立

用PBS將對數(shù)期乳腺癌細胞MCF-7濃度調整為2×107/mL，取0.1 mL懸液注射于小鼠右后側肢體皮下，接種后觀察1周成瘤，將10只成瘤小鼠隨機分為對照組和五味子乙素組，每組5只。五味子乙素組小鼠腹腔注射五味子乙素，每2 d注射1次，直至細胞接種后32 d，每次100 mg/kg，體積0.2 mL;對照組注射等體積PBS。每4 d用游標卡尺測量腫瘤長徑和短徑，腫瘤體積=長徑×短徑2÷2。細胞接種32 d，處死裸鼠，稱取瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組瘤體平均質量-給藥組瘤體平均質量）÷對照組瘤體平均質量×100%。腫瘤組織置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4? Western blot檢測

MCF-7細胞用預冷的細胞裂解液裂解15 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，收取蛋白。腫瘤組織先用液氮進行研磨，然后加入細胞裂解液，離心后獲得腫瘤組織蛋白。BCA比色法計算蛋白濃度，通過SDS-PAGE將蛋白進行分離后，將蛋白轉移至PVDF膜，隨后用5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，根據說明書稀釋一抗，利用封閉液將抗體稀釋到所需濃度，4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌3次×5 min，隨后根據用量，稀釋HRP標記的二抗，37 ℃孵育1 h。用TBST洗滌3次×5 min。用ECL化學發(fā)光檢測，用Image J對圖像進行灰度分析。

2.5? 免疫組化檢測

脫蠟、水化后切片，經1%Triton X-100處理15 min，再用3%H2O2處理10 min，隨后加入Notch-1抗體孵育，置于濕盒4 ℃過夜，第2日清洗后孵育對應的二抗，室溫30 min，最后進行染色封片。染色結果采用DAB顯色法進行觀察，使用蘇木精進行對比染色。

3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據以—x±s表示，用方差分析進行比較，兩組間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4? 結果

4.1? 五味子乙素對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

經不同濃度五味子乙素（0、20、40、80 μmol/L）處理的乳腺癌MCF-7細胞，其對乳腺癌MCF-7細胞增殖的抑制作用具有時間和濃度依賴性，細胞抑制率隨五味子乙素濃度增加和處理時間的延長而增加。結果見表1。

4.2? 五味子乙素對乳腺癌MCF-7細胞Notch-1信號通路相關因子表達的影響

[6] THANDAVARAYAN R A， GIRIDHARAN V V， ARUMUGAM S， et al. Schisandrin B prevents doxorubicin induced cardiac dysfunction by modulation of DNA damage， oxidative stress and inflammation through inhibition of MAPK/p53 signaling[J]. PLoS One，2015，10（3）：e0119214.

[7] JIANG Y， ZHANG Q， BAO J， et al. Schisandrin B suppresses glioma cell metastasis mediated by inhibition of mTOR/MMP-9 signal pathway[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy，2015，74：77-82.

[8] LV X J， ZHAO L J， HAO Y Q， et al. Schisandrin B inhibits the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells by inducing cycle arrest and apoptosis[J]. International Journal of Clinical and Experimental Medicine，2015，8（5）：6926-6936.

[9] YANG X， WANG S， MU Y， et al. Schisandrin B inhibits cell proliferation and induces apoptosis in human cholangiocarcinoma cells[J]. Oncology Reports，2016，36（4）：1799-1806.

[10] LIU X N， ZHANG C Y， JIN X D， et al. Inhibitory effect of schisandrin B on gastric cancer cells in vitro[J]. World Journal of Gastroenterology，2007，13（48）：6506-6511.

[11] DAI X， YIN C， GUO G， et al. Schisandrin B exhibits potent anticancer activity in triple negative breast cancer by inhibiting STAT3[J]. Toxicology and Applied Pharmacology，2018， 358：110-119.

[12] NIE J， ZHAO C， DENG L， et al. Efficacy of traditional Chinese medicine in treating cancer[J]. Biomedical Reports，2016，4（1）：3-14.

[13] LI X， TSAUO J， GENG C， et al. Ginsenoside Rg3 decreases NHE1? expression via inhibiting EGF-EGFR-ERK1/2-HIF-1α pathway in hepatocellular carcinoma：A novel antitumor mechanism[J]. The American Journal of Chinese Medicine，2018，46（8）：1915-1931.

[14] ZHOU R， CHEN H， CHEN J， et al. Extract from Astragalus membranaceus inhibit breast cancer cells proliferation via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine，2018，18（1）：83.

[15] LI Q， LU X H， CAI L， et al. Antiproliferative and apoptosis-inducing activity of schisandrin B against human glioma cells[J]. Cancer Cell International，2015，15（1）：12.

[16] WU Y F， CAO M F， GAO Y P， et al. Down-modulation of heat shock protein 70 and up-modulation of Caspase-3 during schisandrin B-induced apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 cells[J]. World Journal of Gastroenterology，2004，10（20）：2944.

[17] XIANG S S， WANG X A， LI H F， et al. Schisandrin B induces apoptosis and cell cycle arrest of gallbladder cancer cells[J]. Molecules，2014，19（9）：13235-13250.

[18] LIU Z， ZHANG B， LIU K， et al. Schisandrin B attenuates cancer invasion and metastasis via inhibiting epithelial-mesenchymal transition[J]. PLoS One，2012，7（7）：e40480.