張振 郜文輝 田雪飛 陳思勤 何鳳姣 周芳 王亞琪 朱洪兵 李克雄 曾普華

摘要：目的? 觀(guān)察益氣化瘀解毒方對(duì)人肝癌細(xì)胞SMCC-7721自噬流的影響，初步探討其可能的作用機(jī)制。方法? 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組、雷帕霉素組及索拉非尼組，各給藥組給予相應(yīng)藥物。體外實(shí)驗(yàn)觀(guān)察人肝癌細(xì)胞SMCC-7721自噬流發(fā)生情況并檢測(cè)細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC-3Ⅱ）、類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子2的mRNA結(jié)合蛋白質(zhì)（p62）及磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表達(dá)。結(jié)果? 重樓皂苷Ⅰ、益氣化瘀解毒方及索拉非尼均能阻斷人肝癌細(xì)胞SMCC-7721自噬流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬小體的蓄積，上調(diào)LC-3Ⅱ、p62的表達(dá)，同時(shí)可下調(diào)PI3K、mTOR蛋白的表達(dá)。結(jié)論? 益氣化瘀解毒方可改變?nèi)烁伟┘?xì)胞SMCC-7721形態(tài);重樓皂苷Ⅰ、益氣化瘀解毒方及索拉非尼均能阻斷人肝癌細(xì)胞SMCC-7721自噬流，增加自噬體數(shù)量，其機(jī)制可能與抑制PI3K/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：益氣化瘀解毒方;自噬流;人肝癌細(xì)胞SMCC-7721

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A??? 文章編號(hào)：1005-5304（2019）10-0045-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.10.011????? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of Yiqi Huayu Jiedu Prescription on autophagy flow of human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721; To preliminarily discuss its possible mechanism of action. Methods The experiment was divided into blank control group， Chonglou saponin Ⅰ group， Yiqi Huayu Jiedu Prescription group， Rapamycin group and Sorafenib group. Each administration group was given relevant medicine. In vitro experiments were performed to observe the occurrence of autophagy flow in human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721 and to detect the expressions of microtubule-associated protein 1 light chain 3 （LC-3Ⅱ）， insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein （p62） and phosphatidylinositol-3-kinase （PI3K）， mammalian target of Rapamycin （mTOR）. Results Chonglou Saponins Ⅰ， Yiqi Huayu Jiedu Prescription and Sorafenib could block the autophagy flow of human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721， leading to the accumulation of autophagic bodies in cells and up-regulating the expression of LC-3Ⅱ and p62. The expressions of PI3K and mTOR protein could be down-regulated. Conclusion Yiqi Huayu Jiedu Prescription can change cell morphology of SMCC-7721; Chonglou saponins Ⅰ， Yiqi Huayu Jiedu Prescription， and sorafenib can block the autophagy flow of SMCC-7721 and increase the number of autophagic bodies， which may be related to the PI3K/mTOR signal pathway.

Keywords： Yiqi Huayu Jiedu Prescription; autophagy flow; human hepatocellular carcinoma cell SMCC-7721

據(jù)統(tǒng)計(jì)，原發(fā)性肝癌發(fā)病率在惡性腫瘤中居第6位，死亡率居第4位，我國(guó)肝癌患者死亡人數(shù)占全球一半以上[1]。中醫(yī)藥資源豐富，是治療原發(fā)性肝癌的手段之一，長(zhǎng)期服用毒副作用低[2]。有研究表明，中藥在抑制血管新生、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫及改善生活質(zhì)量等方面發(fā)揮了重要的作用[3-4]。益氣化瘀解毒方是全國(guó)名中醫(yī)潘敏求教授治療肝癌效驗(yàn)方。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，其可下調(diào)人肝癌細(xì)胞CXCL12/CXCR4/ CXCR7趨化因子軸，抑制細(xì)胞增殖及遷移，同時(shí)能降低肝癌裸鼠移植瘤血管密度（MVD），抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5-10]。下調(diào)HIF-1α能通過(guò)多種途徑促進(jìn)VEGF的表達(dá)，VEGF是PI3K/mTOR信號(hào)通路上游的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，且PI3K/mTOR信號(hào)通路是參與細(xì)胞自噬的經(jīng)典途徑之一。因此，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究以PI3K/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬性死亡為可能機(jī)制，進(jìn)一步探討益氣化瘀解毒方抗腫瘤的作用途徑，為開(kāi)發(fā)抗肝癌多靶點(diǎn)的中藥新藥提供依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)材料

1.1? 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞SMCC-7721，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2? 藥物

益氣化瘀解毒方（黃芪30 g，白參10 g，半枝蓮 30 g，醋莪術(shù)15 g，甘草5 g），飲片均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房;索拉非尼，南通飛宇生物科技有限公司，批號(hào)FY34720409，20 mg/支，含量≥98%;重樓皂苷Ⅰ，南通飛宇生物科技有限公司，批號(hào)FY11010222，50 mg/支，含量≥98%;雷帕霉素，南通飛宇生物科技有限公司，批號(hào)FY3415RKR089，20 mg/支，含量≥98%。

1.3? 主要試劑與儀器

雙抗（青霉素-鏈霉素）、胎牛血清、PBS、DMEM和胰蛋白酶，Gibco公司;細(xì)胞凍存液，天津?yàn)?mGFP-RFP-LC3（LC3自噬雙標(biāo)腺病毒），漢恒生物;一抗，Abcam公司;BSA，華美公司;PVDF膜，Amersham公司，HRP偶聯(lián)山羊抗鼠、兔IgG，Sigma公司。0.22 mm移液槍?zhuān)℅ilson），細(xì)菌濾器（Millipore），無(wú)菌盒裝吸頭（Axygen），一次性離心管（Corning），細(xì)胞培養(yǎng)皿（Nest biotechology），細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar），巴氏吸管（武漢博士德），氨基載玻片（天津?yàn)螅?，爬片（SORFA），培養(yǎng)瓶（Corning），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司），離心機(jī)（TD5A，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司），倒置顯微鏡（XDS-1B，重慶光電北京有限公司），恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），水浴箱（上海一恒科技有限公司），共聚焦顯微鏡（FV1000，日本Olympus）。

2? 實(shí)驗(yàn)方法

2.1? 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞SMCC-7721接種于高糖培養(yǎng)液中（含10%胎牛血清），置于90%N2-5%CO2-5%O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2? 藥物制備

將益氣化瘀解毒方飲片煎煮并濃縮至每1 mL含1 g原藥材，濾紙粗濾，將藥物按一定比例配制成含中藥的DMEM溶液。使用前將藥液分別稀釋至5 g/L。重樓皂苷Ⅰ：將50 mg樣品溶于0.25 mL DMSO中配制成母液，并將母液溶于DMEM，配制成50 mg/L。索拉非尼：將200 mg樣品溶于DMSO，再將溶有索拉非尼的DMSO溶于DMEM，配制成6 μmol/L溶液。雷帕霉素：將20 mg雷帕霉素溶于DMSO，再將溶有雷帕霉素的DMSO溶于DMEM，配制成4 μmol/L溶液。

2.3? 分組和給藥

實(shí)驗(yàn)分為益氣化瘀解毒方組、重樓皂苷Ⅰ組、雷帕霉素組、索拉非尼組和空白對(duì)照組。每孔加入已配制好的藥液2 mL，干預(yù)24 h。

2.4? 免疫熒光檢測(cè)

取貼壁對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入配制好的腺病毒（1 μL腺病毒∶1 mL DMEM）1 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后加入藥物干預(yù)，24 h后，加入預(yù)冷多聚甲醛2 mL，室溫靜置10 min;用吸水紙吸干，滴入熒光淬滅劑封片，在熒光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。

2.5? Western blot檢測(cè)

取5×104/mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞2 mL接種至6孔板，藥物干預(yù)24 h后，根據(jù)RIPA蛋白抽提試劑說(shuō)明提取各組蛋白，BCA法測(cè)定各組細(xì)胞總蛋白，各組取等量蛋白。然后按樣品∶上樣緩沖液=4∶1比例加入上樣緩沖液并混合均勻，100 ℃水浴10 min，之后置于冰上5 min，加入上樣緩沖液煮沸3 min，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，加一抗稀釋液（LC3、p62、PI3K、mTOR）并將二抗稀釋至1∶3000，室溫孵育1 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法，曝光，顯影，定影，拍照。用Image J進(jìn)行灰度分析，并以β-actin作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 —x±s表示，多組均數(shù)間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 益氣化瘀解毒方對(duì)人肝癌細(xì)胞SMCC-7721自噬流的影響

共聚焦顯微鏡下自噬小體顯示為紅色熒光蛋白（RFP）與綠色熒光蛋白（GFP）merge后的黃色熒光。由于GFP遇酸會(huì)發(fā)生淬滅，因此，自噬溶酶體在熒光顯微鏡下顯示為紅色斑點(diǎn)。與空白對(duì)照組比較，益氣化瘀解毒方組、重樓皂苷Ⅰ組及索拉非尼組人肝癌細(xì)胞SMCC-7721細(xì)胞自噬流均明顯受阻，導(dǎo)致細(xì)胞自噬小體蓄積，益氣化瘀解毒方組與重樓皂苷Ⅰ組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但與索拉非尼組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

4.2? 益氣化瘀解毒方對(duì)人肝癌細(xì)胞SMCC-7721自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ及p62蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組及索拉非尼組均能上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ及p62的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與雷帕霉素組比較，重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組及索拉非尼組均能下調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ及p62的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2、圖3。

4.3? 益氣化瘀解毒方對(duì)人肝癌細(xì)胞SMCC-7721自噬相關(guān)通路PI3K/mTOR蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組和索拉非尼組均能下調(diào)PI3K、mTOR的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與雷帕霉素組比較，重樓皂苷Ⅰ組、益氣化瘀解毒方組和索拉非尼組均能上調(diào)PI3K、mTOR的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4、圖5。

5? 討論

全國(guó)名老中醫(yī)潘敏求教授結(jié)合其多年臨床經(jīng)驗(yàn)，將肝癌病因病機(jī)總結(jié)歸納為“虛”“毒”“瘀”：肝癌患者常見(jiàn)脘腹脹滿(mǎn)、神疲乏力、消瘦、納呆、大便溏結(jié)等為“脾虛”之癥;肝癌病情復(fù)雜、發(fā)展變化快、預(yù)后差，常合并肝炎、肝硬化等病史，同時(shí)多種病理因素夾雜，這些均屬中醫(yī)學(xué)“毒”或“癌毒”范疇;肝癌常見(jiàn)的上腹腫塊及肝區(qū)固定疼痛等，是“瘀”的客觀(guān)表現(xiàn)。癌乃“因虛致癌”，先有正氣不足，而后受外來(lái)“邪毒”侵襲，導(dǎo)致毒瘀互結(jié)而成，癌變進(jìn)一步發(fā)展使正氣更虛，從而又表現(xiàn)出“因癌致虛”的現(xiàn)象，血瘀、邪毒、正氣虛三者始終并存，互為因果，惡性循環(huán)，貫穿于肝癌整個(gè)病程。潘老在此基礎(chǔ)上提出，“健脾理氣、化瘀軟堅(jiān)、清熱解毒”為肝癌基本治法，并擬定益氣化瘀解毒方為治療肝癌基礎(chǔ)方。方中重用黃芪、白參，取其健脾益氣、扶正固表之功，并以醋莪術(shù)化瘀止痛，半枝蓮清熱解毒，甘草調(diào)和諸藥，全方共奏益氣化瘀、清熱解毒之效。

自噬是一把雙刃劍，根據(jù)細(xì)胞環(huán)境和功能狀態(tài)的不同，自噬可提高細(xì)胞活力，或誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡[11]。細(xì)胞自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，自噬體形成增加及自噬溶酶體降解過(guò)程被阻斷，均可使自噬小體蓄積，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。LC3是一種泛素樣蛋白，與自噬體的表達(dá)有密切關(guān)系，在細(xì)胞中以L(fǎng)C3Ⅰ和LC3Ⅱ形式存在，其中LC3Ⅱ主要存在于自噬體膜上，而LC3Ⅰ定位于細(xì)胞質(zhì)中。LC3Ⅱ?qū)τ谧允审w的形成起決定性作用，細(xì)胞去除LC3Ⅱ后，無(wú)法形成完整的自噬小體。而且LC3Ⅱ表達(dá)的多少與自噬體數(shù)量呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，因而成為應(yīng)用最為廣泛的細(xì)胞自噬體標(biāo)記物之一。LC3Ⅱ的高表達(dá)表明自噬小體數(shù)量的蓄積。p62具有多重作用，在自噬體和溶酶體結(jié)合過(guò)程中，為溶酶體提供供體，并引導(dǎo)自噬體與溶酶體結(jié)合，是自噬體降解過(guò)程中的一種選擇性底物蛋白。p62的下調(diào)表明自噬流被活化，而p62的上調(diào)則表明自噬流被阻斷。

PI3K/mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞中關(guān)鍵的復(fù)興自噬調(diào)節(jié)信號(hào)通路。有研究表明，PI3K/mTOR信號(hào)通路的上調(diào)可促進(jìn)腫瘤的惡化[13]。PI3K是普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種蛋白激酶。細(xì)胞中的多種生長(zhǎng)因子，如HIF-1α，可激活細(xì)胞中的酪氨酸激酶，從而激活PI3K。PI3K激活后把PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，PI3P對(duì)自噬囊泡的形成起到了至關(guān)重要的作用。生成的PIP3作用于下游信號(hào)分子蛋白激酶B（Akt），導(dǎo)致Akt構(gòu)象改變，使Akt激活。Akt激活后可直接激活下游信號(hào)分子mTOR。mTOR是PI3K家族中的成員之一，在細(xì)胞自噬過(guò)程中起著重要作用。

本研究結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ、益氣化瘀解毒方及索拉非尼均能抑制細(xì)胞自噬流，導(dǎo)致細(xì)胞自噬小體蓄積，使細(xì)胞損傷死亡，產(chǎn)生抗腫瘤作用，且益氣化瘀解毒方中活性成分可能是重樓皂苷Ⅰ，其機(jī)制可能與下調(diào)PI3K、mTOR蛋白的表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2019-03-25）

（修回日期：2019-04-16;編輯：華強(qiáng)）