歐陽樂軍 馬銘賽 陳梓洛 黃嘉玲 布梁灝 陳自銀 李莉梅

(廣東石油化工學院生物工程學院，茂名 525000)

近年來，隨著越來越多物種全基因組測序的完成，人類已逐步邁進后基因組時代——功能基因組時代。后基因組時代面臨的一個重大挑戰(zhàn)是，如何從大量基因組數(shù)據(jù)庫中獲得特定基因的功能和相應的應用價值信息，而基因定點編輯技術恰恰是解決這一難題的有力工具[1]。2013年，基因定點編輯技術CRISPR/Cas9被研究人員報道，該基因編輯體系只需設計一個sgRNA就可對相關基因進行定點編輯，具有操作簡單、成本低、效率高等特點，成為新一代最受歡迎的基因編輯技術[2]。相比傳統(tǒng)的轉基因技術，CRISPR/Cas9技術表達載體插入位點與基因編輯的位點不同，外源插入質粒待基因編輯完成后，可在后代配子形成過程中染色體分離時而被去除，編輯后不留下轉基因的痕跡，無須引入外源基因，因而生物安全性高，無轉基因爭議，應用前景廣闊[3～4]。但怎樣快速篩選獲得不含外源轉化元件的基因編輯后代是一個關鍵技術問題[5]。

本研究創(chuàng)造性的將擬南芥種皮特異性啟動子At2S3與熒光篩選標記基mCherry組裝進植物基因組定點編輯的CRISPR載體pHDE中，以擬南芥as1為靶基因[6]，構建一種帶有熒光篩選標記且可在轉化后代中實現(xiàn)Cas9等外源轉化元件有效分離剔除的基因安全、高效編輯體系，并在擬南芥進行驗證研究，為建立一種更為生態(tài)安全、更高編輯效率的CRISPR/Cas9技術體系提供借鑒與參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DH5α感受態(tài)細胞(鼎國MCC001)、GV3101農桿菌感受態(tài)細胞(鼎國)、pHDE基礎載體(本實驗室保存)、含mCherry與啟動子的載體pHDE-mCherry質粒由加州大學圣地亞哥分校趙云德教授提供。高保真PFU酶、DNA Marker、限制性內切酶BsaⅠ購置NEB中國公司。本實驗所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體的構建

1.2.1.1 靶位點的選擇及引物序列

根據(jù)CRISPRscan找到目標基因as1的高評分靶點為目標序列。利用rgenome評估高評分靶點的脫靶情況，運用SnapGene軟件進行載體構建分析，運用Primer Premier 5軟件進行引物分析；運用DNAMAN軟件進行序列分析(表1)。

表1 研究所用引物信息

1.2.1.2 重組質粒pHDE-At2S3-mCherry的構建

以含有所要擴增目的基因的質粒pHDE-mCherry為模板，分別擴增種皮特異性啟動子(At2S3)和熒光篩選標記基因(mCherry)，以上述At2S3和mCherry的PCR產物為模板，用At2S3啟動子的正向引物IDP-F和mCherry反向引物mCherry-R進行PCR擴增，電泳檢驗并切膠回收得到At2S3+mCherry的片段。將此片段與酶切后的pHDE質粒進行重組。熱擊法轉化大腸桿菌、菌落PCR驗證，將陽性質粒送樣測序驗證，具體載體構建方法參照歐陽樂軍等[7]。載體構建各元件組成如圖1所示。

圖1 pHDE-At2S3+mCherry-as1重組質粒示意圖Fig.1 Schematic representation of recombinant plasmid pHDE-At2S3+mCherry-as1

1.2.1.3 重組質粒pHDE-At2S3-mCherry-as1的構建

PCR擴增as1-gRNA，切膠回收后與酶切過的pHDE-At2S3-mCherry質粒進行重組。熱擊法轉化大腸桿菌，并進行菌落PCR驗證，對陽性重組質粒測序驗證。

1.2.2 工程菌的制備及擬南芥轉化

采用凍融法，將測序正確的重組質粒pHDE-At2S3-mCherry-as1轉進農桿菌，并進行菌落PCR驗證，制備工程菌液。經花序浸染法浸泡擬南芥的花苞，收集轉化后的種子，通過580 nm波長下的熒光顯微鏡篩選帶有紅色熒光的種子，種植培育獲得T1代轉化植株。

1.2.3as1基因編輯效率鑒定

在目標基因as1的兩個靶序列上下游設計鑒定引物as1-GT1與as1-GT2，對挑選出的T1代紅色熒光種子培育的植株用PCR儀(ABI Veriti 96)進行PCR及測序鑒定，PCR引物見表1，PCR反應條件(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)為94℃預變性4 min，40個循環(huán)(94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 450 s)，最后72℃延伸2 min。因兩個target的靶序列設計將使目標基因as1模板從中間大片段敲除，純合突變只能擴增得到一個小片段，雜合突變將得到大小兩個片段，而野生型只能擴增出一個大片段。

1.2.4 Cas9外源轉化元件的分離鑒定

以表達載體上的Cas9序列設計Cas9鑒定引物(表1)，以T1代帶紅色熒光種子與T2無熒光種子后代植株基因組為模板，擴增Cas9序列，擴增反應程序同1.2.3，擴增結束后進行電泳鑒定。

2 結果與分析

2.1 表達載體的構建結果及分析

2.1.1 重組質粒pHDE-At2S3-mCherry的構建

限制性內切酶BsaⅠ酶切后載體pHDE與At2S3-mCherry進行連接,連接產物轉化DH5α后菌落PCR鑒定,陽性克隆擴增出800 bp左右的特異性片段，大小與At2S3-mCherry片段大小相符。提取鑒定結果為陽性的菌液質粒，測序結果正確，證明重組載體pHDE-At2S3-mCherry構建成功。PCR及測序鑒定結果如圖2所示。

圖2 重組質粒pHDE-At2S3-mCherry構建PCR A.At2S3的PCR擴增；B.篩選標記基因mCherry的PCR擴增；C.At2S3+mCherry的片段PCR擴增；D.陽性菌落PCR驗證Fig.2 PCR amplification of pHDE-At2S3-mCherry A.PCR amplification of the 35S promoter; B.PCR amplification of mCherry; C.PCR amplification of At2S3+mCherry fragment; D.PCR verification of Positive colony

圖3 目的片段as1-gRNA片段的PCR擴增 1.DNA標準品；2.為擴增后的目的片段Fig.3 PCR amplification of the as1-gRNA 1.DNA standard; 2.PCR amplification of target fragments

圖4 重組質粒PCR驗證 1.DNA標準品；2～3.重組質粒PCR；4.陰性對照；5.陽性對照Fig.4 PCR verification of recombinant plasmid 1.DNA standard; 2～3.PCR amplification of recombinant plasmid; 4.Negative control; 5.Positive control

2.1.2 重組質粒pHDE-At2S3+mCherry-as1的構建

將線性化的載體與PCR擴增得到的as1片段組裝，重組質粒經熱擊法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，質粒PCR鑒定后，選擇陽性質粒送樣測序(圖3～4)。測序結果顯示as1片段成功插入，pHDE-At2S3+mCherry-as1載體構建成功。

2.2 擬南芥轉化及突變體鑒定結果

采用花序浸染法浸泡擬南芥的花苞，農桿菌轉化成功后的T1代種子在熒光顯微鏡下具有紅色熒光(圖5:A)，挑選有熒光的種子培育得到T1代植株，Cas9 PCR鑒定結果為陽性(圖8)。隨機提取部分植株基因組進行as1的PCR檢測，17顆T1代植株中共有7株轉化后代可以擴增出一條小帶的純合突變，純合突變的比率達到41%(圖6)，與野生型相比，突變性狀明顯(圖5:C,D)，與已知的as1突變體性狀相同。將擴增得到的純合突變小帶回收送樣至上海生工廣州測序部測序，結果與實驗設計預期的編輯效果完全一致，在兩個target間成功編輯了405 bp大小的堿基(圖7)。圖中標記位置為前后兩個target的PAM位置前3個堿基處，在此中間的405 bp堿基序列被成功敲除。

2.3 外源轉化元件在純合突變體中的分離鑒定

從純合突變的的T1代種子中篩選出不帶熒光的種子，培育得到T2代植株，提取基因組對外源Cas9等轉化元件進行PCR鑒定，結果擴增不到Cas9序列，說明不帶熒光的種子后代已不含有外源Cas9轉化元件(圖9)，

圖5 擬南芥突變體與野生型的表型比較 A.熒光種子和野生型種子;B.擬南芥野生型幼苗；C～D.突變純合體幼苗Fig.5 The Phenotypic comparison of Arabidopsis mutants and wild type A.Fluorescent seeds and Wild seeds; B.The Arabidopsis wild-type seedling; C-D.Themutant homozygotes seedling

圖6 T1代植株中純合突變PCR鑒定 M.DNA標準品； 1～17.T1代植株，純合突變：3～5、7、9、12、13；雜合突變：1、2、8、10-11、16；18.野生型對照Fig.6 PCR identification of mutant in T1 plants M.DNA standard；1-17.Homozygous mutation of T1 generation plants; 3-5、7、9、12、13；Heterozygous mutation of T1 generation plants; 1,2,8,10-11,16；18.Wild-type

圖7 純合突變測序結果圖Fig.7 The sequencing result of homozygous mutation

圖8 T1代植株中Cas9基因PCR鑒定圖 M.DNA標準品；1～2.陽性與陰性對照；3～8.T1代純合編輯植株Fig.8 PCR identification of Cas9 in T1 plants M.DNA standard；1-2.Positive and negative control; 3-8.Homozygous mutation of T1 generation plants

圖9 T2代植株Cas9基因PCR鑒定圖 M.DNA標準品；1.野生型；2～16.T2代純合編輯植株Fig.9 Identification of target genes knockout in T2 plants M.DNA standard; 1.Wild-typecontrol; 2-16.Homozygous mutation of T2 generation plants

3 討論

CRISPR/Cas9技術與傳統(tǒng)植物轉基因技術相比，具有更明顯的實際應用價值與優(yōu)勢。一是傳統(tǒng)的轉基因技術具有插入位點的隨機性與不確定性，易產生其他內源基因破壞、外源基因沉默等現(xiàn)象，使基因的精確修飾與改造效率低下；其次是CRISPR/Cas9技術體系在完成對靶標基因的遺傳編輯之后通過后代配子形成過程中染色體的分離而去除，在編輯后代中不留下轉基因的痕跡，無須引用外源基因，生物安全性高，特別是隨著CRISPR/Cas9技術的進一步成熟，其所具有的優(yōu)勢得到進一步顯現(xiàn)。應用范圍也將越來越廣泛，對于任何物種的基因組定點編輯都將成為可能[8～10]。

本研究通過設計兩對sgRNA，使其同時識別基因靶序列，提高靶標識別特異性，在T1代中獲得純合突變子的概率高達40%以上。同時，通過將種皮特異性啟動子At2S3和mCherry熒光蛋白偶聯(lián)在載體中，在熒光顯微鏡特定波長的照射下，利用熒光蛋白所發(fā)出的特殊熒光，實現(xiàn)對突變體的可視化篩選，提高篩選效率。最后特異性的利用CRISPR/Cas9技術體系在完成對靶標基因的遺傳編輯之后通過后代配子形成過程中染色體的分離而去除，在編輯后代中不留下轉基因的痕跡，無須引用外源基因，生物安全性高的特點，應用外源轉化元件中帶有熒光蛋白的標記特性，先篩選帶有熒光的種子，提高獲得轉化后代陽性植株比例，隨后從純合突變中挑選不帶熒光的轉化后代，將外源轉化元件實現(xiàn)成功分離，獲得不帶有Cas9等轉化元件的基因編輯后代，這種通過可視化熒光篩選標記來快速判斷種子中是否含有CRISPR/Cas9表達系統(tǒng)的方法簡單易行，準確率高，對基因編輯事件的初步檢測只需要進行簡單的PCR分析即可，極大的提高了工作效率。本研究構建的一種帶有可視化篩選標記的大片段基因編輯方法，為有性繁殖作物基因編輯后代中獲得無外源轉化元件的新種質資源提供了一種全新的技術參考，具有一定的創(chuàng)新性[11～12]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種有效的基因編輯工具，具有操作簡單，高效性和特異性等其他基因編輯工具所不具備的優(yōu)勢[13～16]。研究人員可以有效的針對不同基因進行編輯，深入研究基因功能，還可一次編輯多個基因，對于多基因控制的信號通路中互作機制等基礎科學問題研究以及多基因調控的農林作物重要經濟、農藝性狀遺傳改良具有十分明顯的應用價值[17～18]。想要更好的實現(xiàn)對CRISPR/Cas9的應用，研究人員還面臨如何減少脫靶現(xiàn)象的發(fā)生以及進一步提高基因編輯效率？隨著CRISPR/Cas9的廣泛應用與深入開展，科技工作者一定可以更好的利用CRISPR/Cas9技術為人類的生產生活服務[19～20]。