高江婧，任聰，劉國(guó)英，葛向陽(yáng)，王慧琳，葉方平，徐巖*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，釀造微生物學(xué)與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州，236820) 3(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

在濃香型白酒釀造生產(chǎn)實(shí)踐中，通常采用“雙輪底發(fā)酵工藝”來(lái)提高酒質(zhì)，雙輪底糟發(fā)酵實(shí)質(zhì)是延長(zhǎng)發(fā)酵期的一種工藝方法[1-2]。受夏季氣溫過(guò)高因素的影響，酒醅發(fā)酵溫度較難控制，很多名優(yōu)酒廠采取暫停生產(chǎn)措施以安全度夏，這勢(shì)必會(huì)造成酒醅發(fā)酵周期的延長(zhǎng)。而長(zhǎng)期的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)表明，延長(zhǎng)酒醅發(fā)酵時(shí)間后，所釀造出的濃香型原酒品質(zhì)更佳。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者逐步重視對(duì)濃香型白酒酒醅中的微生物菌群演替規(guī)律進(jìn)行解析。多數(shù)研究表明，在發(fā)酵過(guò)程中，酒醅中的乳酸菌成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，乳酸菌在發(fā)酵初期快速繁殖，發(fā)酵中后期相對(duì)豐度呈緩慢上升趨勢(shì)[3-5]；劉凡等[6]通過(guò)宏基因組測(cè)序解析了濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的微生物與主要有機(jī)酸合成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)窖內(nèi)發(fā)酵初期(0～14 d)與主要有機(jī)酸(乳酸、乙酸、丁酸和己酸)合成相關(guān)的微生物數(shù)量顯著高于發(fā)酵后期(15～60 d)。上述有關(guān)酒醅微生物菌群的研究均針對(duì)的是2個(gè)月的常用發(fā)酵周期，尚未揭示出延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間后窖內(nèi)酒醅微生物菌群和風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律。

窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，目前對(duì)窖泥的微生物菌群結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)逐步清晰，研究發(fā)現(xiàn)地域、窖齡、窖內(nèi)分布位置、窖泥質(zhì)量均對(duì)窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)具有較大的影響，如新窖泥以乳桿菌為主，而老窖泥以梭菌綱、擬桿菌綱和產(chǎn)甲烷菌為主[7-12]。王雪山等[13]分析了濃香型酒醅微生物的來(lái)源，發(fā)現(xiàn)大曲是酒醅中好氧和兼性厭氧菌的主要來(lái)源(占比74%)，而窖泥是酒醅厭氧菌群的主要來(lái)源(占比14%)，但窖泥微生物菌群對(duì)酒醅微生物菌動(dòng)態(tài)變化的影響卻鮮有研究。另一方面，濃香型白酒發(fā)酵窖池深達(dá)2 m，對(duì)發(fā)酵過(guò)程酒醅取樣，尤其是對(duì)底層酒醅取樣困難，發(fā)酵后期較多的黃水也對(duì)酒醅取樣造成困難，目前尚缺少對(duì)濃香型白酒發(fā)酵窖池底層酒醅中微生物與風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生動(dòng)態(tài)規(guī)律的長(zhǎng)發(fā)酵周期追蹤研究。本文跟蹤了發(fā)酵周期長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的窖池，并重點(diǎn)關(guān)注了窖池下層酒醅中的主要風(fēng)味物質(zhì)和微生物菌群的變化規(guī)律，為解析延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間與原酒品質(zhì)關(guān)系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

在濃香型白酒釀造車間，選取正常生產(chǎn)班組的2口老窖池，窖齡均為27年。采用自制酒醅取樣器分別取樣不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的酒醅樣本，連續(xù)跟蹤取樣直至156 d發(fā)酵結(jié)束。本文取樣的酒醅樣本均為窖池下部的酒醅。發(fā)酵結(jié)束后，采用五點(diǎn)取樣法取窖泥100 g并混合均勻。酒醅和窖泥樣本均凍存于-20℃冰箱待用。

1.2 主要試劑

己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、乳酸、丁酸、己酸、叔戊醇、乙酸正戊酯和2-乙基丁酸等標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)：購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司；無(wú)水乙醇(色譜純)：購(gòu)于上海安譜公司；DNA提取試劑盒：購(gòu)于美國(guó)Qiagen公司。

1.3 揮發(fā)性組分分析

稱取酒醅(窖泥)樣本10 g，加入60%的無(wú)水乙醇20 mL渦旋混勻，浸提30 min后，10 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)膜，并加入混合內(nèi)標(biāo)(叔戊醇、乙酸正戊酯和2-乙基丁酸)后進(jìn)行氣相色譜分析。色譜柱為CP-wax57CB毛細(xì)管柱(50m×0.25mm×0.25μm)，氣相進(jìn)樣口溫度為230℃，檢測(cè)器溫度為230℃，載氣為高純氮，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為30∶1。程序升溫條件為：初始溫度35℃，保持0 min,以4 ℃/min升到60℃，保持4 min,再以6 ℃/min升到195 ℃，保持20 min。

1.4 乳酸分析

酒醅(窖泥)樣本用超純水浸泡離心，并經(jīng)適當(dāng)稀釋后，采用超高效液相色譜法[14]測(cè)試上清液的乳酸含量。色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)，流動(dòng)相為0.02 mol/L KH2PO4，流速為0.1 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm。

1.5 酒醅和窖泥微生物DNA的提取

對(duì)于酒醅樣本，采用滅菌的PBS緩沖液多次提取酒醅中的微生物細(xì)胞，以去除雜質(zhì)，收集細(xì)胞沉淀，然后采用DNeasy UltraClean Microbial Kit提取酒醅微生物總基因組DNA。窖泥微生物總基因組DNA利用DNeasy Power-Soil Kit進(jìn)行提取，提取方法按照試劑公司提供的實(shí)驗(yàn)操作指南進(jìn)行。利用瓊脂糖電泳對(duì)提取的微生物DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格后進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序。

1.6 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

建庫(kù)與測(cè)序由上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。高通量測(cè)序針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)域，擴(kuò)增引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′)。測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq。測(cè)序原始序列采用FLASH和Trimmomatic軟件進(jìn)行拼接及質(zhì)控過(guò)濾，序列的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)為：(1)去除序列尾部質(zhì)量值20以下的堿基，去除質(zhì)控后50 bp以下的序列；(2)引物最大錯(cuò)配數(shù)為2，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，去除模糊堿基；(3)最小overlap序列長(zhǎng)度為10 bp，且拼接序列的overlap區(qū)允許最大錯(cuò)配比率為0.2。采用Uchime軟件去除嵌合體序列。使用Usearch(vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/)將序列按照97%相似度聚類，進(jìn)行OTU(operational taxonomic units，操作分類單元)劃分，提取代表序列，得到OTU表。將細(xì)菌OTU代表序列與Silva(Release132，http://www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)行分類學(xué)注釋。細(xì)菌菌群熱圖(heatmap)和冗余分析(redundancy analysis，RDA)通過(guò)R語(yǔ)言(vegan包)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅主要風(fēng)味物質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢(shì)

在濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中，靠近窖池底部的下層酒醅質(zhì)量最佳，一般用于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)濃香型原酒。對(duì)窖池下層酒醅的4種主要有機(jī)酸進(jìn)行測(cè)試分析，結(jié)果表明乳酸含量在總酸中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(>85%)，其次是乙酸、己酸和丁酸。在整個(gè)156 d長(zhǎng)的發(fā)酵周期內(nèi)，乳酸含量在發(fā)酵初期0 ～14 d快速增加，之后乳酸含量增速變緩，在發(fā)酵120 d后乳酸含量有略微下降的趨勢(shì)(圖1-A)。乙酸則在發(fā)酵初期0～21 d快速增加，之后略有緩慢增加趨勢(shì)。而丁酸和己酸的含量在發(fā)酵50 d后持續(xù)增加，直至發(fā)酵結(jié)束(圖1-B)。由此可知，對(duì)于較短的發(fā)酵周期(60 d以內(nèi))，酒醅中的丁酸、己酸并未大量積累，這與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道基本一致[6]。

與此同時(shí)，酒醅中的乳酸乙酯和乙酸乙酯兩種風(fēng)味組分與乳酸、乙酸的變化趨勢(shì)基本一致，在發(fā)酵初期，乳酸乙酯和乙酸乙酯呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)，20 d后則逐漸趨于平穩(wěn)，而酒醅中己酸乙酯的含量則在長(zhǎng)期發(fā)酵的后期迅速增加(圖1-C)，表明在濃香型白酒釀造工藝中，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，可以顯著提高酒醅中己酸乙酯的含量。己酸乙酯含量的提高，相應(yīng)提高了己酸乙酯與乙酸乙酯的比值，因而延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，也有利于促進(jìn)白酒中酯類物質(zhì)的平衡。

2.2 酒醅原核微生物隨發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢(shì)

為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)窖池下層酒醅在長(zhǎng)期發(fā)酵過(guò)程中的微生物變化規(guī)律，對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的酒醅細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。酒醅16S rRNA基因測(cè)序表明，酒醅中的細(xì)菌主要以芽孢桿菌綱的乳桿菌科(Lactobacillaceae)為主，乳桿菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，因而乳桿菌的代謝產(chǎn)物乳酸在總酸中也占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在發(fā)酵14 d時(shí)，乳桿菌科的相對(duì)豐度達(dá)到99%以上，這與發(fā)酵初期酒醅中的乳酸含量急劇增長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)，表明乳桿菌科在發(fā)酵初期即大量繁殖，代謝產(chǎn)生高含量的乳酸。但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳桿菌科的相對(duì)豐度逐漸下降至85%左右(圖2)。相反，梭菌綱微生物的相對(duì)豐度則逐漸增加至8.94%。

A-乳酸；B-揮發(fā)酸；C-酯類物質(zhì)圖1 酒醅發(fā)酵過(guò)程中主要風(fēng)味物質(zhì)含量變化Fig.1 Dynamics of key flavor compounds in fermented grains during fermentation

A-綱水平;B-科水平圖2 酒醅細(xì)菌菌群隨發(fā)酵時(shí)間變化規(guī)律Fig.2 Dynamic of bacterial community in fermented grains during fermentation注：圖中數(shù)據(jù)為相同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)酒醅樣本測(cè)序結(jié)果的平均值。下同。

由于乳桿菌科在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度均大于80%，當(dāng)扣除乳桿菌科后，可觀測(cè)到酒醅中梭菌綱微生物的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出顯著遞增趨勢(shì)。在科水平上，梭菌綱的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和梭菌科(Clostridiaceae_1)的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加。除乳桿菌科的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)下降外，r-變形菌綱的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)也隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低(圖3)。

A-綱水平;B-科水平圖3 酒醅扣除乳桿菌科后的細(xì)菌菌群隨發(fā)酵時(shí)間變化規(guī)律Fig.3 Dynamic of bacterial community expect for Lactobacillaceae in fermented grains during fermentation

2.3 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅微生物與窖泥微生物的相關(guān)性

由于窖泥是酒醅厭氧微生物菌群的重要來(lái)源，王雪山等通過(guò)微生物來(lái)源(SourceTracker)分析酒醅微生物的來(lái)源，發(fā)現(xiàn)窖泥來(lái)源厭氧菌占到酒醅原核菌群的14%[13]。將不同發(fā)酵時(shí)間的酒醅微生物與窖泥微生物的種類分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒醅與窖泥中檢測(cè)到的共有微生物種類逐漸增多，在科水平上，從發(fā)酵14 d的28個(gè)共有微生物增加至140 d的82個(gè)共有微生物(圖4)。

A-發(fā)酵14 d;B-發(fā)酵56 d；C-發(fā)酵140 d圖4 不同發(fā)酵時(shí)間酒醅與窖泥共有微生物(科水平)比較分析Fig.4 Comparison of communal microorganisms (at family level) between pit mud and fermentedgrains at different fermentation time注：FG-14d表示發(fā)酵14 d的酒醅；FG-56d表示發(fā)酵56 d的酒醅；FG-140 d表示發(fā)酵140 d的酒醅；PM表示窖泥。下同。

通過(guò)比較窖泥和不同發(fā)酵時(shí)間酒醅的微生物差異，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，隨發(fā)酵時(shí)間在酒醅中相對(duì)豐度逐漸升高的微生物，如瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、Dysgonomonadaceae、梭菌科(Clostridiaceae_1)，這些微生物也是窖泥中的高豐度微生物，它們?cè)诮涯嘀械钠骄鄬?duì)豐度分別為24.79%、22.35%、13.01%(圖5)。表明在長(zhǎng)期發(fā)酵過(guò)程中，窖泥為酒醅持續(xù)不斷提供其主體的厭氧微生物菌群。值得說(shuō)明的是，瘤胃菌只是細(xì)菌分類學(xué)名稱，最初命名源于從牛瘤胃中發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生丁酸的某種新類型厭氧菌，而窖泥中的瘤胃菌屬于該科下的新成員，與定義該科源自于瘤胃的細(xì)菌并不是同屬細(xì)菌，它們只是在科水平上的親緣關(guān)系上較為接近。

A-菌群結(jié)構(gòu)；B-變化規(guī)律圖5 窖泥菌群結(jié)構(gòu)和對(duì)應(yīng)的酒醅菌群隨發(fā)酵時(shí)間變化規(guī)律Fig.5 The bacterial community of pit mud and dynamic of bacterial community in fermented grains during long-termfermentation注：數(shù)據(jù)為樣本測(cè)序結(jié)果的平均值，菌群為科水平。

此外，窖泥中平均相對(duì)豐度較高的一些微生物，如Rikenellaceae (9.13%)和Cloacimonadaceae(3.15%)，它們?cè)诰契械南鄬?duì)豐度并未同比例增加，后者甚至在酒醅中檢測(cè)不到；而窖泥中平均相對(duì)豐度較低的Heliobacteriaceae(0.47%)在酒醅中的相對(duì)豐度卻較高。雖然窖池下部酒醅在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)半固態(tài)(由于原料水解和微生物的代謝活動(dòng)，酒醅中的水分含量較高)，窖泥微生物可以通過(guò)遷移或擴(kuò)散進(jìn)入酒醅，但本文研究結(jié)果表明，從窖泥遷移至酒醅中的微生物并非是同比例增加的，酒醅的高酸高醇環(huán)境也可能影響窖泥微生物向酒醅的遷移速率和生長(zhǎng)代謝。而與此相對(duì)的是，酒醅中雖富含有80%以上高豐度的乳桿菌，但其在窖泥中的相對(duì)豐度卻僅有1%左右，表明即使在長(zhǎng)期的發(fā)酵過(guò)程中，酒醅中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的乳桿菌并未能大量入侵到窖泥微生物體系中，正常窖泥微生物菌群具有較好的魯棒性，能夠抵抗酒醅中乳酸菌的入侵。

2.4 風(fēng)味物質(zhì)與微生物的相關(guān)性分析

上述分析比較了不同發(fā)酵時(shí)間酒醅和發(fā)酵終點(diǎn)窖泥細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)豐度逐漸增高的物種亦是窖泥中的主體功能菌群。為進(jìn)一步分析這些微生物與發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)生成是否相關(guān)，我們進(jìn)行了冗余分析(RDA)(圖6)。結(jié)果表明，乳桿菌科的相對(duì)豐度與乳酸含量呈強(qiáng)正相關(guān)，而丁酸、乙酸、己酸含量則與梭菌科、瘤胃菌科、Dysgonomondaceae的相對(duì)含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。因此，推測(cè)這些微生物對(duì)發(fā)酵后期己酸、丁酸、乙酸的合成具有重要貢獻(xiàn)。

圖6 微生物與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析Fig.6 Correlation between microbes and flavor compounds

3 討論

本文對(duì)長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月發(fā)酵周期的窖池下層酒醅進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵初期(0～14 d)，由于乳桿菌的大量繁殖，酒醅乳酸含量迅速增加，此后乳桿菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。乳桿菌在發(fā)酵初期即大量繁殖，其代謝生成的高濃度乳酸抑制了無(wú)耐酸性能的微生物或有害菌的生長(zhǎng)，避免了發(fā)酵過(guò)程受到這些微生物的污染。相對(duì)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的乳桿菌而言，梭菌綱微生物占比較小，雖然梭菌綱微生物的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)顯著遞增趨勢(shì)，但即使到發(fā)酵140 d時(shí)，其平均相對(duì)豐度也僅占總細(xì)菌的8.94%。雖然酒醅中的梭菌綱微生物在數(shù)量上不占優(yōu)勢(shì)，但其對(duì)酒醅風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)卻巨大。

任聰?shù)萚15]通過(guò)對(duì)新、老窖泥的微生物菌群結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)窖泥中的主體己酸菌為梭菌綱瘤胃菌科的己酸菌屬(Caproiciproducens)微生物，且以乳酸和葡萄糖利用型己酸菌為主。本文通過(guò)跟蹤長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的發(fā)酵過(guò)程中窖池下層酒醅微生物的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，梭菌綱瘤胃菌科的微生物在酒醅中的相對(duì)豐度逐漸增加，并觀測(cè)到在長(zhǎng)期發(fā)酵的后期(120 d后)，酒醅中的乳酸含量亦有略微的下降趨勢(shì)，而丁酸、己酸含量則隨發(fā)酵期的延長(zhǎng)持續(xù)增加。推測(cè)窖泥中的主體產(chǎn)己酸菌進(jìn)入酒醅后，可將乳酸底物逐漸轉(zhuǎn)化為丁酸和己酸，從而為酯類物質(zhì)的合成不斷提供充足的前體物質(zhì)。

對(duì)酒醅菌群和窖泥菌群比較可知，酒醅中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的乳桿菌在窖泥中的相對(duì)豐度卻較低，表明即使在長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的發(fā)酵過(guò)程中，酒醅中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的乳桿菌并未能入侵到窖泥微生物體系中。有研究表明，新窖池的窖泥以高含量的乳桿菌為主要特征[7, 15]，新窖池的窖泥由于厭氧菌群物種多樣性低，尚未形成穩(wěn)定的菌群結(jié)構(gòu)，推測(cè)在長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵過(guò)程中，新窖池酒醅中的乳桿菌可能會(huì)入侵至窖泥體系中。本文所取樣的酒醅和窖泥均為老窖池的樣本，老窖池的窖泥具有豐富的厭氧菌群，在長(zhǎng)時(shí)間的酒醅發(fā)酵過(guò)程中，不僅能抵御酒醅中乳桿菌的入侵，而且老窖泥中的主體微生物能不斷遷移至酒醅層中。因此酒醅的發(fā)酵期越長(zhǎng)，從老窖泥遷移至酒醅中的窖泥微生物越多，代謝生成的丁酸、己酸等有機(jī)酸含量也越多。

綜上所述，對(duì)于老窖池而言，延長(zhǎng)酒醅發(fā)酵時(shí)間后，一方面，窖泥中的主體厭氧微生物不斷遷移進(jìn)入酒醅，使得酒醅中的丁酸、己酸等有機(jī)酸含量持續(xù)積累；另一方面，也為有機(jī)酸與乙醇通過(guò)酯化反應(yīng)生成酯類風(fēng)味物質(zhì)提供了更為充足的時(shí)間，因而發(fā)酵后期(120 d后)，在酒醅中檢測(cè)到了己酸乙酯的大量合成。此外，己酸作為濃香型白酒重要風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯的前體物質(zhì)，其可作為衡量濃香型原酒品質(zhì)的重要指征性指標(biāo)。本文也主要對(duì)酒醅中高含量的有機(jī)酸(乳酸、乙酸、己酸、丁酸)和相應(yīng)的酯類物質(zhì)進(jìn)行了分析，然而很多其他微量風(fēng)味物質(zhì)(如戊酸、辛酸、丁酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、己酸丁酯等)對(duì)濃香型白酒風(fēng)格的形成也具有重要作用[16-18]，因此在長(zhǎng)期發(fā)酵過(guò)程中，酒醅中其他微量風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律仍有待深入分析。

雖然延長(zhǎng)酒醅發(fā)酵時(shí)間對(duì)提高酒質(zhì)有諸多優(yōu)勢(shì)，但也存在出酒率偏低、窖池周轉(zhuǎn)率偏低等問(wèn)題。另外，現(xiàn)有對(duì)窖泥微生物的研究表明，窖泥中亦存在一些產(chǎn)異嗅味的微生物[19-21]，這些微生物在長(zhǎng)期發(fā)酵過(guò)程中對(duì)原酒品質(zhì)的影響有待深入研究。