蔡翠翠， 寧慶慶， 陳秋明， 祝遠(yuǎn)魁， 陳寧博， 陳 宏， 雷初朝*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院，寧夏 固原 756000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.湖南天華實(shí)業(yè)有限公司，湖南 漣源 417126)

中國(guó)黃牛根據(jù)外貌特征、地域分布和遺傳學(xué)特點(diǎn)被分為三大類型：北方黃牛(黃河以北地區(qū))、中原黃牛(黃河以南至長(zhǎng)江以北地區(qū))和南方黃牛(長(zhǎng)江以南地區(qū))。湘西黃牛屬于湖南省湘西地區(qū)獨(dú)有的黃牛品種，主要分布在湖南省湘西土家族苗族自治州，為巫陵牛品種的一個(gè)重要組成部分，并于2012年通過(guò)國(guó)家商標(biāo)局注冊(cè)評(píng)審獲得“湘西黃?！钡乩順?biāo)志商標(biāo)[1]。湘西黃牛主要分布于湖南省的鳳凰、桑植、永順、慈利、花垣等縣，具有體質(zhì)結(jié)實(shí)、肢蹄強(qiáng)健、耐勞耐寒、抗?jié)衲痛诛暤葍?yōu)良特性[2-3]。湘西黃牛作為肉役兼用型黃牛品種，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化能夠促進(jìn)湘西肉牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其分子遺傳研究對(duì)開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)湘西黃牛遺傳資源有很重要的意義。

動(dòng)物的Y染色體的非重組區(qū)(MSY區(qū))遵循父系單向遺傳，且Y染色體單倍型完整、突變率低、不易受重組和回復(fù)突變等因素影響，是進(jìn)化事件的忠實(shí)記錄者，故此為家牛的起源進(jìn)化、遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)等研究的重要工具[4]。近年來(lái)，Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)作為第3代分子遺傳標(biāo)記被廣泛用于動(dòng)物遺傳多樣性和動(dòng)物起源進(jìn)化方面研究[5]。研究發(fā)現(xiàn)，全世界的家牛有3種Y染色體單倍型組，分別為普通牛Y1和Y2單倍型組以及瘤牛Y3單倍型組[5]。Ginja等[6]利用3個(gè)Y-SNPs(DDX3Y、UTY-19和ZFY)標(biāo)記對(duì)13個(gè)葡萄牙本地牛品種的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)葡萄牙牛中有荷斯坦牛的血統(tǒng)，也揭示了其單倍型以及與地理分布和表型特征的關(guān)系。Li等[7]利用4個(gè)Y-SNPs(ZFY9、ZFY10、UTY19和USP9Y)對(duì)中國(guó)16個(gè)北方、中原和南方黃牛品種的Y染色體單倍型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)北方黃牛中普通牛Y2單倍型組占91.4%，南方黃牛中瘤牛Y3單倍型組占90.8%，而中原黃牛含有普通牛Y2和瘤牛Y3兩種混合單倍型組；從Y2和Y3單倍型組頻率可看出中國(guó)黃牛的地理分布規(guī)律，即從北方到南方雄性瘤牛血統(tǒng)滲入比例越來(lái)越高。

姚一博等[8]利用湘西黃牛線粒體DNA D-loop區(qū)序列分析了其母系遺傳及遺傳多樣性，但有關(guān)湘西黃牛Y染色體的父系起源、遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)至今未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用2個(gè)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)標(biāo)記對(duì)湘西黃牛的父系起源、遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，以期為今后開(kāi)展湘西黃牛的分子育種和資源保種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取

在湖南省湘西州鳳凰縣湘西黃牛保種場(chǎng)采集24頭湘西黃牛公牛耳組織樣，放于75%的酒精帶回實(shí)驗(yàn)室低溫保存。采用常規(guī)酚—氯仿抽提法對(duì)其基因組DNA進(jìn)行提取，稀釋至10～20 ng/μL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

參照已發(fā)表的家牛Y染色體2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記[5-7](UTY-19和ZFY-10)合成2對(duì)引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系(12.5 μL)：2×EsTaqMasterMix(Dye) 6.25 μL，ddH20 4.75 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.25 μL，模板DNA 1 μL。

PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃(見(jiàn)表1)退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含Goldview核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，將檢測(cè)合格的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序和單倍型分析

將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA測(cè)序儀進(jìn)行正、反向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)Chromas 2.6.5軟件進(jìn)行查看和校正，獲得每頭湘西黃牛公牛的2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)測(cè)序結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體的單倍型組，再用Arlequin 3.11軟件計(jì)算單倍型多樣度。

表1 家牛2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記的相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)24頭湘西黃牛公牛的2個(gè)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)多態(tài)性標(biāo)記測(cè)序進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：UTY-19標(biāo)記的堿基存在C和A兩種SNPs，頻率分別為12.5%和87.5%；ZFY-10標(biāo)記的堿基也存在C和T兩種SNPs，頻率分別為12.5%和87.5%；通過(guò)試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理分析，發(fā)現(xiàn)UTY-19和ZFY-10標(biāo)記SNPs中的C與A和C與T相對(duì)應(yīng)，并確定湘西黃牛的單倍型組。根據(jù)Gotherstrom等[5]和Ginja等[6]對(duì)Y染色體單倍型的判定標(biāo)準(zhǔn)，湘西黃牛有Y1和Y3兩種單倍型組(表2)。其中3頭湘西黃牛公牛屬于普通牛Y1單倍型組，頻率為12.5%(3/24)；21頭湘西黃牛公牛屬于瘤牛Y3單倍型組，頻率為87.5%(21/24)，表明湘西黃?？赡苡衅胀ㄅ：土雠?種父系起源并以瘤牛起源為主，且其地域分布屬于南方黃牛類型，這與中國(guó)南方黃牛的起源進(jìn)化相一致。湘西黃牛的Y染色體單倍型多樣度為0.2283±0.0978，表明遺傳多樣性相對(duì)較低，品種純度較高。

表2 湘西黃牛Y染色體單倍型與單倍型頻率

3 討 論

Y染色體核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)作為第3代分子遺傳標(biāo)記已被廣泛用于動(dòng)物的父系起源、遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面[9-13]。常振華等[9]利用4個(gè)Y-SNPs(DDX3Y-7、UTY-19、ZFY-9和ZFY-10)標(biāo)記分析了我國(guó)16個(gè)地方黃牛品種的Y染色體遺傳多樣性，結(jié)果顯示中國(guó)黃牛存在Y2和Y3兩種單倍型組，且自北到南Y2單倍型組頻率逐漸降低，而Y3單倍型組頻率逐漸增加。Xia等[10]對(duì)我國(guó)34個(gè)地方黃牛品種進(jìn)行Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)多態(tài)性標(biāo)記分析，表明中國(guó)黃牛存在普通牛Y2和瘤牛Y3兩種單倍型組，其中在中國(guó)北方和中原地區(qū)Y2單倍型組占優(yōu)勢(shì)，而在南方地區(qū)Y3單倍型組占優(yōu)勢(shì)。趙曉誠(chéng)等[11]對(duì)30頭嶺南黃牛公牛的2個(gè)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)嶺南黃牛中存在普通牛Y2和瘤牛Y3兩種單倍型組，但以瘤牛Y3單倍型組為主(93.33%)。馬志杰等[12]對(duì)62頭柴達(dá)木黃牛公牛的2個(gè)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)柴達(dá)木黃牛公牛有Y1(21%)和Y2(79%)兩種普通牛單倍型組。姚一博等[8]等通過(guò)對(duì)33頭湘西黃牛mtDNA D-loop區(qū)全序列分析，共檢測(cè)到55個(gè)變異位點(diǎn)并確定了15個(gè)mtDNA單倍型，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，湘西黃牛有普通牛和瘤牛兩種母系起源，受瘤牛影響更大。

本研究以24頭湘西黃牛公牛為對(duì)象，同樣采用2個(gè)Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)多態(tài)性標(biāo)記分析方法，確定了湘西黃牛有普通牛Y1和瘤牛Y3兩種單倍型組，其中瘤牛Y3單倍型組占主導(dǎo)地位(87.5%)，說(shuō)明湘西黃牛主要是瘤牛父系起源，與中國(guó)黃牛的地理分布規(guī)律[7,9-11]基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)湘西黃牛的Y-SNP遺傳多樣度為0.2283±0.0978，低于Edwards[14]等報(bào)道的138個(gè)國(guó)外牛品種的平均Y染色體單倍型多樣度0.422±0.300，表明湘西黃牛具有較低的父系遺傳多樣性和較高的品種純度。本研究發(fā)現(xiàn)湘西黃牛有歐洲牛Y1單倍型組的血統(tǒng)，也解釋了近20年來(lái)為了提高湘西黃牛的生產(chǎn)效率而引入歐美優(yōu)良品種(如安格斯牛、短角牛)雜交改良使得群體遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的現(xiàn)象[1]。由于中國(guó)地方黃牛Y1單倍型組的概率很低，說(shuō)明中國(guó)地方黃牛Y1單倍型組很可能是引進(jìn)歐美商品肉牛品種，如安格斯牛與短角牛等[7,9-11]。因此，本研究推測(cè)湘西黃牛中的Y1單倍型組很可能是與安格斯?；蚨探桥Ｋ耓1]。為了避免湘西黃牛遺傳資源的流失，建議進(jìn)一步加強(qiáng)湘西黃牛保種區(qū)和保種場(chǎng)中湘西黃牛的純種選育、提高和保護(hù)，以期為今后開(kāi)展湘西黃牛的分子育種、資源開(kāi)發(fā)利用工作提供種質(zhì)來(lái)源。