陳代遠(yuǎn)，陳良建,2，鄭景璞，易曼菲，邵春生，張博

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南長沙，410013；2.中南大學(xué)粉末冶金國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙，410083)

理想的骨組織修復(fù)材料要求材料體系應(yīng)具有優(yōu)異的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性和可控降解性，結(jié)構(gòu)體系應(yīng)具有高孔隙率且相互連通的多孔結(jié)構(gòu)，同時應(yīng)具備與自然骨組織相匹配的力學(xué)強(qiáng)度。以磷酸鈣為代表的生物陶瓷材料因其具備良好的生物相容性與骨傳導(dǎo)性、降解產(chǎn)物無毒副作用，能在體液環(huán)境中與骨組織形成良好的骨性結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)[1]，是骨修復(fù)支架材料的研究熱點(diǎn)。不同的磷酸鈣基生物材料，其生物活性、降解速率等表征不同，羥基磷灰石(HAp)在體液環(huán)境中穩(wěn)定，降解性低；磷酸三鈣(β-TCP)在體液環(huán)境中降解較快；由HAp 和β-TCP 組成的雙相磷酸鈣(BCP)，降解性介于HAp 與β-TCP 之間,骨誘導(dǎo)性優(yōu)于單純的HAp 與β-TCP。研究發(fā)現(xiàn)，多孔BCP有利于血管長入，是較理想的骨修復(fù)支架基材[2]。高孔隙率且相互連通的多孔結(jié)構(gòu)是骨長入支架的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，本課題組前期采用冰模板法制備了層板狀多孔HAp/BaTiO3復(fù)合材料，研究發(fā)現(xiàn)層板狀排列的多孔陶瓷其力學(xué)強(qiáng)度明顯優(yōu)于無序多孔陶瓷，且層板狀多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞黏附、增殖和分化[3-4]。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境,對維持細(xì)胞的生理活動具有重要作用。膠原、透明質(zhì)酸作為天然存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的生物高分子材料，具有極強(qiáng)的親水性和極低的免疫原性。RGD 為精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸組成的短肽序列，存在于多種生物細(xì)胞外基質(zhì)中，具有特異性配體，能夠通過介導(dǎo)受體-配體的結(jié)合來促進(jìn)多種類型細(xì)胞的黏附[5]，是細(xì)胞在ECM中附著和遷移的識別部位。在多孔BCP支架材料表面構(gòu)建仿細(xì)胞外基質(zhì)涂層，能否有利于細(xì)胞的黏附、增殖及分化尚有待于研究。本文作者通過改良冰模板法，制備具有仿生層板狀結(jié)構(gòu)的多孔雙相磷酸鈣支架，并在支架層板表面制備仿細(xì)胞外基質(zhì)涂層，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究支架結(jié)構(gòu)及不同涂層對支架細(xì)胞相容性的影響。

1 材料和方法

1.1 多孔BCP支架材料的制備與性能評價

將粒徑為1～5 μm 的HAp 和β-TCP 粉末按質(zhì)量比為30:70 的比例機(jī)械球磨24 h，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%助燒劑氧化鎂粉、體積分?jǐn)?shù)為4%黏接劑聚乙烯醇(PVA)、體積分?jǐn)?shù)為0.9%表面活性劑聚丙烯酸胺，溶于去離子水中配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的BCP漿料，改良傳統(tǒng)冰模法，將底部冷源轉(zhuǎn)為中心冷源，制定個性化模具，控制中心冷源溫度在-25 ℃、外周溫度1～4 ℃下冷凍2 h，制得的坯樣經(jīng)真空冷凍干燥后，置于箱式電阻爐中以1 ℃/min升溫至550 ℃后保溫3 h 脫酯，隨后以5 ℃/min 升溫至1 250 ℃燒制成型，保溫2 h 后隨爐冷卻至室溫。掃描電子顯微鏡(SEM)觀察樣品結(jié)構(gòu)特征；阿基米德排水法檢測樣品孔隙率；萬能力學(xué)性能試驗(yàn)機(jī)檢測樣品的力學(xué)性能。

1.2 多孔BCP支架仿ECM涂層的制備

1.2.1 明膠（gelatin，GEL）涂層制備

將1.0 g GEL 顆粒和49 mL 滅菌去離子水置于55 ℃恒溫水浴箱中用玻璃棒攪拌溶解30 min，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%GEL 溶液，調(diào)節(jié)pH 至5.0 后，將試樣完全浸于含GEL 溶液的滅菌培養(yǎng)皿中，并在37 ℃恒溫水浴30 min，取出后置于37 ℃恒溫干燥箱中干燥48 h，低溫等離子消毒。

1.2.2 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）涂層制備

稱取50 mg HA 粉末加入50 mL 滅菌去離子水中，玻璃棒充分?jǐn)嚢?0 min，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的HA溶液，將試樣完全浸于含HA溶液的滅菌培養(yǎng)皿中30 min，取出后置于37 ℃恒溫干燥箱中干燥48 h，低溫等離子消毒。

1.2.3 明膠-透明質(zhì)酸（gelatin-hyaluronic acid，GEL-HA）涂層制備

將制備好GEL 涂層的BCP 支架移至含HA 溶液的滅菌培養(yǎng)皿中，并在浸泡30 min 后置于37 ℃恒溫干燥箱中干燥48 h，低溫等離子消毒。

1.2.4 明膠-透明質(zhì)酸-摻RGD（gelatin-hyaluronic acid-RGD，GEL-HA-RGD）涂層制備

將5 mg RGD 加入盛有50 mL 滅菌PBS 溶液的燒杯中充分溶解30 min，稱取50 mg HA 粉末加入燒杯后玻璃棒攪拌30 min，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的HA-RGD 溶液，將預(yù)先制備好GEL 涂層的BCP 支架移至含上述HA-RGD 溶液的滅菌培養(yǎng)皿中，封口浸泡30 min后置于37 ℃恒溫干燥箱中干燥48 h，低溫等離子消毒。

1.2.5 SEM檢測

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，85%和100%酒精梯度脫水后臨界點(diǎn)干燥、噴金，將未涂層的多孔BCP 及具有仿ECM涂層的多孔BCP試樣置于掃描電鏡下觀察涂層表面形貌。

1.3 多孔BCP 支架及其仿ECM 涂層的體外性能評價

1.3.1 CCK8 法評價支架及其仿ECM 涂層對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性

1)浸提液的制備。設(shè)實(shí)驗(yàn)組為GEL 組(A 組)、HA 組(B 組)、GEL-HA 組(C 組)、GEL-HA-RGD 組(D組)和未涂層組(E組)，將各組試樣按3.0 g/mL的比例分別浸泡于含新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基(1640細(xì)胞培養(yǎng)液和體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清)的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，封口后置于37 ℃、含5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，取浸提液分別配制成體積分?jǐn)?shù)為100%，50%和10%3個梯度的實(shí)驗(yàn)浸提液，于4 ℃保存。

2)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。取處于生長對數(shù)期的L929細(xì)胞配制成5×104個/mL細(xì)胞懸液，按100 μL/孔接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 至貼壁完全。實(shí)驗(yàn)組分別用精密移液槍加入10 μL 各濃度浸提液，對照組(F 組)加入10 μL 含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1 640 細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照組(G 組)加入10 μL 苯酚溶液，并設(shè)空白孔(僅細(xì)胞培養(yǎng)基不含細(xì)胞)，共8組，每組設(shè)3個復(fù)孔，后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于24 h和48 h 2個時間點(diǎn)在超凈工作臺內(nèi)給每孔加入10 μL CCK-8 細(xì)胞毒性試劑，繼續(xù)孵育2 h待細(xì)胞培養(yǎng)基顯色后取出，用全自動酶標(biāo)儀在波長450 nm 處測定每孔的吸光度，計(jì)算均值及標(biāo)準(zhǔn)差并計(jì)算細(xì)胞相對增殖率。

1.3.2 CCK8法評價支架及其仿ECM涂層對MG63細(xì)胞增殖能力的影響

分組同上，每組設(shè)3個復(fù)孔，將已傳2代、處于生長期的MG63細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液配制成2×104個/mL細(xì)胞懸液，取2 mL細(xì)胞懸液接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)各組支架上，后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在共培養(yǎng)第1，3 和7 天根據(jù)CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑說明書操作，用全自動酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定各孔吸光度并比較各組差異。

1.3.3 評價支架及其仿ECM 涂層對MG63 細(xì)胞黏附能力的影響

分組同上，每組設(shè)3個復(fù)孔，將已傳2代、處于生長期的MG63細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液配制濃度為2.0×104個/mL的細(xì)胞懸液，取2 mL細(xì)胞懸液接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)各組支架上，置于培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)7 d 和14 d，同一時間點(diǎn)取出裝入50 mL 離心管，加入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定后置于4 ℃保存。梯度酒精脫水、干燥、噴金，SEM 觀察MG63 細(xì)胞在各組支架表面的黏附形態(tài)及數(shù)量。

1.3.4 評價支架及其仿ECM 涂層對MG63 細(xì)胞分化功能的影響

分組同上，每組設(shè)3個復(fù)孔，將已傳2代、處于生長期的MG63細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液配制濃度為2.0×104個/mL的細(xì)胞懸液，取2 mL細(xì)胞懸液接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)各組支架上，置于培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3，7 和14 d，同一時間點(diǎn)吸取各孔的上清液置于EP 管中，于4 ℃保存。按人骨堿性磷酸酶(ALP)及骨鈣素(BGP)測定試劑盒的說明書進(jìn)行操作，用全自動酶標(biāo)儀在450 nm 波長處測定各孔的吸光度并記錄，分別比較各組ALP及BGP含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，所有計(jì)量資料用均值(xˉ)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間差異比較采用方差分析，當(dāng)P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多孔BCP 及其仿ECM 涂層試樣微觀結(jié)構(gòu)特征

采用改良冰模板法制備的多孔BCP 支架其基本結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示，可見通過復(fù)制冰晶的生長方向支架結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出層板狀且具有顯著的各向異性，該支架中心區(qū)是直徑為2.5～3.0 mm 大孔，孔隙呈層板狀，層板結(jié)構(gòu)清晰且由內(nèi)向外呈放射狀排列，層板間可見間隔形成二級孔隙及多級孔隙(圖1(b)箭頭所示)、中心大孔與小孔之間互相連結(jié)貫通，層板間距離為88.15～89.61 μm，板層厚度為21.86～37.16 μm，孔隙短徑為50～100 μm，長徑與層板的長度一致(圖1(a)紅線所示)；通過阿基米德排水法，以無水乙醇為介質(zhì)測得的總孔隙率為71.0%±2.1%；支架壓縮強(qiáng)度為(0.70±0.04)MPa。

具有仿ECM涂層的多孔BCP支架微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示。從圖2可見：涂層在多孔BCP支架的層板表面均勻覆蓋，層板間結(jié)構(gòu)未見明顯改變，各級孔隙清晰通暢，無明顯雜質(zhì)堵孔。其中，以明膠為主的涂層表面形貌呈微球狀(圖2(a))，而以透明質(zhì)酸涂層為主的涂層表面形貌呈均質(zhì)狀(圖2(b))。

2.2 多孔BCP 支架及其仿ECM 涂層的體外性能評價

2.2.1 多孔BCP支架及其仿ECM涂層對L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果

用CCK8法檢測各組試樣細(xì)胞毒性，圖3所示為各組試樣浸提液與L929 細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 后在倒置顯微鏡下照片。從圖3可見：細(xì)胞均勻覆蓋底壁，細(xì)胞間緊密相連，細(xì)胞呈三角形或多邊形，偽足生長充分，貼壁良好，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較，在細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)方面無明顯差異，陽性對照見細(xì)胞呈圓球形(圖3(g))，已失去正常細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)。

根據(jù)CCK8法測定24 h的吸光度如圖4所示，由各組吸光度計(jì)算出相對增殖率(relative appreciation rate，RGR)，并根據(jù)RGR 進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(CTS)。多孔BCP 支架及其仿ECM 涂層試樣浸提液與L929 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 的相對增殖率見圖5。由圖5可見：多孔BCP及其不同涂層試樣浸提液中細(xì)胞相對增殖率均大于75%，細(xì)胞毒性分級均為0或1級，說明本研究所制備的多孔BCP及其表面仿ECM 涂層對L929 細(xì)胞無毒性，符合GB/T 16886.5—2003中對材料的細(xì)胞毒性要求。

圖1 多孔BCP支架結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of porous BCP calcium phosphate pore structure

圖2 具有不同涂層的多孔BCP支架掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of porous BCP scaffolds with different coatings

圖3 多孔BCP支架及其仿ECM涂層試樣浸提液與L929細(xì)胞共培養(yǎng)48h倒置顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 Inverted microscope Images of porous BCP scaffold and its ECM-coated sample extracts co-cultured with L929 cells for 48 h

圖4 多孔BCP支架及其仿ECM涂層試樣浸提液與L929細(xì)胞共培養(yǎng)24 h的細(xì)胞毒性吸光度Fig.4 Cytotoxicity absorbance of porous BCP scaffold and its ECM-coated sample extracts co-cultured with L929 cells for 24 h

2.2.2 多孔BCP 支架及其仿ECM 涂層對MG63 細(xì)胞的細(xì)胞增殖影響

圖5 多孔BCP支架及其仿ECM涂層試樣浸提液與L929細(xì)胞共培養(yǎng)24 h的相對增殖率Fig.5 RGR of porous BCP scaffold and its ECM-coated sample extracts co-cultured with L929 cells for 24 h

圖6所示為各組各時間點(diǎn)通過CCK8法所測得的吸光度及其比較，其中，ns 表示組與組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即P＞0.05。從圖6可知：1 d時各個實(shí)驗(yàn)組與對照組之間吸光度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異(P＞0.05)，4個實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)差異不顯著(P＞0.05)，3 d 時明膠-透明質(zhì)酸涂層組和明膠-透明質(zhì)酸-RGD涂層組的吸光度較其余各組差異具有顯著性，7 d時明膠-透明質(zhì)酸-RGD涂層組的吸光度較其余各組差異具有顯著性，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與對照組均可促進(jìn)MG63 細(xì)胞的增殖能力，其中2 種或2種以上膜材的復(fù)合涂層優(yōu)于單一涂層，GEL-HARGD涂層組促進(jìn)作用最佳。

2.2.3 多孔BCP 支架及其仿ECM 涂層對MG63 細(xì)胞的細(xì)胞黏附影響

圖6 多孔BCP支架及其仿ECM涂層試樣與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)1，3和7 d的細(xì)胞增值吸光度(*P＜0.05)Fig.6 Cell proliferation absorbance of porous BCP and its bionic ECM coating co-cultured with MG63 cells for 1,3 and 7 d(*P＜0.05)

圖7所示為各實(shí)驗(yàn)組與MG63 細(xì)胞共培養(yǎng)7 d的掃描電鏡圖。從圖7可見：不同涂層細(xì)胞黏附形貌及黏附數(shù)目不同，E組試樣表面MG63細(xì)胞呈長三角形或橢圓形，細(xì)胞伸展不充分，偽足少，細(xì)胞黏附數(shù)量少(見圖7(e))；A 組及B 組試樣表面，MG63 細(xì)胞呈長梭型，伸長較充分，可見偽足延伸，但細(xì)胞間聯(lián)系不緊密，偽足少，細(xì)胞黏附密度底(見圖7(a)和(b))；C 組及D 組試樣表面，MG63 細(xì)胞充分伸展偽足，偽足末端與涂層融合，細(xì)胞聚集成團(tuán)，或局部增殖偽足相互連接形成細(xì)胞網(wǎng)狀生長，黏附于板層表面，細(xì)胞黏附密度比A，B和E組的高(見圖7(c)和(d))。

2.2.4 多孔BCP 支架及其仿ECM 涂層對MG63 細(xì)胞分化功能的影響

圖8和圖9所示分別為多孔BCP 支架及其仿ECM 涂層在與MG63 細(xì)胞共培養(yǎng)3，7 和14 d 后對細(xì)胞分化功能的影響。由圖8和圖9可見：隨時間延長，各組ALP 和BGP 的濃度均增加，其中具有仿ECM涂層的多孔BCP支架與未涂層的多孔BCP支架與各時間點(diǎn)上ALP 和BGP 的濃度比較均有顯著差異(P＜0.05)，在4 種仿ECM 涂層組組間比較中，ALP 濃度從3 d 開始，C 組和D 組的吸光度較其余各組差異具有顯著性，且D組顯著性比C組的強(qiáng)(見圖8)；BGP濃度在3 d時各涂層組差異不顯著(P＞0.05)，從7 d 開始C 組和D 組吸光度較其余各組差異具有顯著性(P＜0.05)，且D組顯著性比C組的強(qiáng)(見圖9)。從上述結(jié)果可看出：4 種仿ECM 涂層在不同時間點(diǎn)對MG63 細(xì)胞分泌ALP 及BGP 的影響不同，4種涂層均能促進(jìn)MG63細(xì)胞的分化功能，2種或2種以上膜材的復(fù)合涂層優(yōu)于單一涂層，明膠-透明質(zhì)酸-摻RGD涂層組促進(jìn)作用最佳。

圖7 多孔BCP支架及其仿ECM涂層試樣與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)7 d的電鏡圖Fig.7 SEM images of porous BCP and its bionic ECM coating samples co-cultured with MG63 cells for 7 d

圖8 多孔BCP支架及其仿ECM涂層試樣與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)的堿性磷酸酶吸光度(*P＜0.05)Fig.8 ALP absorbance of porous BCP scaffolds and its bionic ECM coated samples co-cultured with MG63 cells(*P＜0.05)

圖9 多孔BCP支架及其仿ECM涂層試樣與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)的骨鈣素吸光度(*P＜0.05)Fig.9 BGP absorbance of porous BCP scaffolds and its bionic ECM coated samples co-cultured with MG63 cells(*P＜0.05)

3 討論

一般認(rèn)為高孔隙率且相互連通的多孔結(jié)構(gòu)是骨長入支架的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在天然骨組織中，小梁骨的高度互連的多孔結(jié)構(gòu)賦予其獨(dú)特的機(jī)械、生理和生物學(xué)特性。因此，具有高度連通結(jié)構(gòu)的多孔骨修復(fù)支架材料是目前骨修復(fù)材料的研究熱點(diǎn)。多孔結(jié)構(gòu)、孔徑、孔隙度都影響支架材料的力學(xué)性能及成骨效果，通常制備多孔磷酸鈣的方法有造孔劑法[6]、發(fā)泡法[7]、有機(jī)泡沫浸漬法[8]、溶膠-凝膠法[9]和冰模板法等[10]，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，如造孔劑法可制備各種孔隙結(jié)構(gòu)的樣品，但其孔隙均勻性差，孔隙率低；發(fā)泡法制備的樣品多為閉孔結(jié)構(gòu)；溶膠-凝膠法能制備孔隙分布均勻的樣品，但孔徑小；有機(jī)泡沫浸漬法能制備孔隙率高、孔徑可調(diào)的樣品，但不能控制孔隙的生成方向；冰模板法在多孔陶瓷制備方面有優(yōu)勢，可通過調(diào)節(jié)工藝參數(shù)來調(diào)控材料的孔隙度、孔徑和孔隙方向，提高多孔材料的力學(xué)強(qiáng)度[11]。本研究根據(jù)自然骨結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用改良冰模板法，得到一種總孔隙率為71.0%±2.1%、壓縮強(qiáng)度為(0.70±0.04) MPa、結(jié)構(gòu)為中心大孔，孔隙呈板層狀且由內(nèi)向外呈放射狀排列的仿生多孔磷酸鈣支架，層板間可見間隔形成二級孔隙，多級孔隙、中心大孔與小孔之間互相連結(jié)貫通，層板間孔隙距離為88.15～89.61 μm，板層厚度為21.86～37.16 μm，孔隙短徑為50～100 μm，長徑與板層的長度一致。這種結(jié)構(gòu)為支架內(nèi)成骨提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究表明：當(dāng)磷酸鈣支架的孔徑為20～500 μm時，支架的蛋白質(zhì)吸附能力增強(qiáng)[12]；隨著微孔數(shù)及多級孔隙的增加，磷酸鈣支架蛋白吸附能力增強(qiáng)。另外，磷酸鈣支架的孔徑影響支架內(nèi)成骨和血管的形成[13]，研究發(fā)現(xiàn)在孔徑約50 μm 或更大時，可見血管和骨組織向內(nèi)生長[14]。然而，當(dāng)孔徑大于100 μm 時，會影響磷酸鈣的機(jī)械強(qiáng)度和形狀[15]。OTSUKI等[16]的進(jìn)一步研究表明，相互連通的多孔結(jié)構(gòu)為體液因子、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的交換以及代謝物的排泄提供了良好結(jié)構(gòu)條件，孔隙的相互連通性可能是骨骼向內(nèi)生長的更重要因素。本實(shí)驗(yàn)獲得了一種孔隙有序且相互連通、孔徑可控的仿生支架，該支架在促進(jìn)支架內(nèi)成骨方面具有結(jié)構(gòu)優(yōu)勢。

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是體內(nèi)細(xì)胞生長的微環(huán)境，主要由纖維結(jié)構(gòu)蛋白(如膠原蛋白)、多糖(如透明質(zhì)酸)以及蛋白多糖等組成,對維持細(xì)胞的生理活動具有重要作用，細(xì)胞與ECM 的粘連受特定的細(xì)胞表面黏附分子如整合素的受體和配體(如RGD)的調(diào)節(jié)。為提高生物活性，盡量縮短材料骨整合時間，對骨修復(fù)支架材料表面進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)仿生是合理并且必要的。本實(shí)驗(yàn)在多孔BCP 支架表面構(gòu)建了以明膠、透明質(zhì)酸為主的4 種仿ECM 涂層，其中明膠的肽鏈中富含氨基酸，具有羥基、羧基、氨基等多個活性基團(tuán)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、黏附等，同時明膠能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化以及形成骨結(jié)節(jié)[17-18]，透明質(zhì)酸為酸性的黏多糖，作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，具有非抗原性，其生理功能是吸附水分進(jìn)入細(xì)胞間隙，在細(xì)胞周圍形成含豐富營養(yǎng)物質(zhì)的微環(huán)境，并能與液體環(huán)境中的蛋白質(zhì)結(jié)合而形成蛋白凝膠、黏聚細(xì)胞的同時增大細(xì)胞接觸面積，但因其自身特性又能使細(xì)胞之間保持獨(dú)立，發(fā)揮細(xì)胞的正常代謝作用，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[19-20]，本實(shí)驗(yàn)通過體外研究，發(fā)現(xiàn)具有仿ECM 涂層的試樣對細(xì)胞增殖的作用均強(qiáng)于無涂層試樣，明膠-透明質(zhì)酸復(fù)合涂層試樣對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用強(qiáng)于單一涂層試樣，提示復(fù)合涂層兼具兩者特點(diǎn)，且可能存在協(xié)同效應(yīng)。

成骨細(xì)胞的黏附與擴(kuò)散的活力是細(xì)胞與支架表面相互作用第一階段的初始因素，并且該階段的質(zhì)量將影響細(xì)胞在骨移植物上增殖和分化的能力[21]?？紫堵试礁撸缺砻娣e越大，就能為細(xì)胞遷移和向內(nèi)生長提供更多空間。研究發(fā)現(xiàn)粗糙的表面結(jié)構(gòu)、良好的表面化學(xué)組成與親水性、高表面能和適合的表面電荷有利于成骨細(xì)胞的黏附[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)具有仿生ECM 涂層的試樣表面細(xì)胞黏附的數(shù)量、形態(tài)、伸展?fàn)顩r均優(yōu)于未涂層的試樣，且明膠-透明質(zhì)酸涂層對MG63 細(xì)胞的黏附作用強(qiáng)于單一涂層，且明膠-透明質(zhì)酸-摻RGD涂層更能促進(jìn)細(xì)胞的黏附。其可能原因如下：明膠、透明質(zhì)酸均具有良好的親水性，涂層提高了多孔BCP材料的表面能，從而有利于支架對細(xì)胞的吸附作用[17,19]。明膠-透明質(zhì)酸涂層兼具明膠、透明質(zhì)酸的特點(diǎn)，因此優(yōu)于單一涂層。而摻雜的RGD 位于復(fù)合涂層表面或包裹于兩涂層間，直接發(fā)揮對細(xì)胞黏附的促進(jìn)作用或隨涂層降解發(fā)揮作用。

ALP 作為成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志，BGP 作為成骨細(xì)胞進(jìn)入骨礦化階段的重要指標(biāo)，通過檢測兩者的含量可反映支架對細(xì)胞分化的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，具有仿ECM涂層的試樣其ALP和BGP的活性明顯高于未涂層試樣，明膠-透明質(zhì)酸復(fù)合涂層試樣對MG63細(xì)胞分化的促進(jìn)作用均高于單一涂層組，且明膠-透明質(zhì)酸-摻RGD 涂層試樣MG63細(xì)胞分化的促進(jìn)作用最佳，可能原因是：支架材料相互連通的多孔結(jié)構(gòu)以及表面涂層構(gòu)建了良好的微環(huán)境，且具有復(fù)合涂層的支架材料對細(xì)胞黏附、增殖能力的影響均優(yōu)于單一涂層的支架，隨著細(xì)胞黏附量的增加，細(xì)胞形態(tài)以及伸展情況的改變也能促進(jìn)細(xì)胞的分化[22]。

從上述討論得知：仿ECM 涂層支架對MG63細(xì)胞功能的作用優(yōu)于未涂層支架，明膠-透明質(zhì)酸復(fù)合涂層試樣對MG63細(xì)胞功能的作用優(yōu)于單一涂層，明膠-透明質(zhì)酸-摻RGD 涂層試樣對MG63 細(xì)胞增殖、黏附、分化功能的作用均優(yōu)于其他各組。

4 結(jié)論

1)用改良冰模板法制備一種具有高孔隙率的、結(jié)構(gòu)為中心大孔，孔隙呈板層狀且相互連通的仿生多孔磷酸鈣支架。

2)用浸潤干燥法能在多孔BCP 孔隙內(nèi)表面制備明膠、透明質(zhì)酸、明膠-透明質(zhì)酸、明膠-透明質(zhì)酸-摻RGD 等仿ECM 涂層，以明膠為主的涂層表面形貌呈微球狀，而以透明質(zhì)酸涂層為主的涂層表面形貌呈均質(zhì)狀。

3)多孔BCP及其表面仿ECM涂層試樣均無細(xì)胞毒性。

4)明膠涂層、透明質(zhì)酸涂層、明膠-透明質(zhì)酸涂層、明膠-透明質(zhì)酸-摻RGD涂層的試樣均可促進(jìn)MG63 細(xì)胞的增殖、黏附與分化，且明膠-透明質(zhì)酸-摻RGD涂層試樣對MG63增殖、黏附與分化的促進(jìn)作用最佳。