袁春營 孟陽 吳佩佩

摘要：利用透明圈法和搖瓶發(fā)酵法從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底泥中篩選出1株淀粉酶高產(chǎn)菌株，掃描電子顯微鏡觀察菌株的亞顯微形態(tài)，生化方法測(cè)定了菌株的生理生化指標(biāo)，分子生物學(xué)方法分析了菌株的16S rRNA序列，同時(shí)響應(yīng)面法優(yōu)化了該菌株的產(chǎn)酶條件。結(jié)果表明，根據(jù)菌株的亞顯微形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA序列比對(duì)，確定該菌株為盧森坦擬諾卡氏菌（Nocardiopsis lucentensis）;該菌株的最適產(chǎn)酶條件為初始pH值8.8、鹽度60‰、溫度40 ℃。篩選到的淀粉酶高產(chǎn)菌株，能夠?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)提供耐鹽堿淀粉酶儲(chǔ)備菌株。

關(guān)鍵詞：淀粉酶;盧森坦擬諾卡氏菌;亞星微形態(tài);生理生化特征;RNA序列對(duì)比;產(chǎn)酶條件;響應(yīng)法

中圖分類號(hào)： S182 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0288-04

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一類酶的統(tǒng)稱，其產(chǎn)量約占工業(yè)酶總產(chǎn)量的85%以上。淀粉酶在食品、焙烤、發(fā)酵、紡織、輕工業(yè)、畜牧業(yè)生產(chǎn)及醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[1-5]。但是在工業(yè)化生產(chǎn)中高鹽、堿性等嚴(yán)苛條件制約著淀粉酶的應(yīng)用。在此條件下，淀粉酶的穩(wěn)定性下降，酶活力大幅度損失或者完全喪失，因此開發(fā)具有高穩(wěn)定性的生物酶，使其能夠適應(yīng)高鹽、堿性等工業(yè)環(huán)境，成為近年來亟待解決的重要難題。嗜鹽細(xì)菌對(duì)外界自然環(huán)境的鹽度具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，是一類重要的極端微生物資源。嗜鹽菌可以在較高的鹽度環(huán)境中生長，其最適鹽濃度一般為0.5%～36.0%[6]。為了適應(yīng)高鹽度環(huán)境，這類細(xì)菌產(chǎn)生的各種酶往往具有一些獨(dú)特的生物學(xué)特性，如耐鹽、耐高或低pH值、耐堿等。因此，篩選高效耐鹽堿淀粉酶產(chǎn)生菌株，并將其應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，具有重要的科學(xué)意義與實(shí)踐價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌株從天津市漢沽南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底泥中篩選得到。

1.1.1 培養(yǎng)基 改良察氏培養(yǎng)基：NaNO3 3.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4 0.01 g、可溶性淀粉30.00 g、蒸餾水1.00 L，pH值7.2～7.4，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉1.8%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。改良LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 15 g、可溶性淀粉10 g、蒸餾水1 L，pH值 7.2～7.4，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉1.8%，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司;化學(xué)試劑均為分析純，購自北京索來寶生物科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 立式雙層小容量恒溫培養(yǎng)搖床（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;全溫型多振幅軌道搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）; 立式蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;PCR擴(kuò)增儀（美國伯樂公司）;高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）;精密pH計(jì)（天津市盛邦科學(xué)儀器技術(shù)開發(fā)有限公司）;CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）;電子分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 淀粉酶產(chǎn)生菌株的篩選 取1 g池塘底泥，加入已滅菌的100 mL察氏培養(yǎng)基中，于30 ℃、120 r/min下恒溫振蕩富集培養(yǎng)，3 d后取5 mL培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接至察氏培養(yǎng)基中，相同條件培養(yǎng)3 d。

無菌條件下對(duì)富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，并在固體察氏培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，30 ℃培養(yǎng)，3 d后在平板上滴數(shù)滴碘液，選取透明圈明顯的菌株進(jìn)行平板劃線分離純化。經(jīng)過復(fù)篩，獲得淀粉酶高產(chǎn)菌株，編號(hào)為EPM。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征 菌株純化后接種到察氏培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，革蘭氏染色觀察菌體的顯微形態(tài)，掃描電鏡下觀察菌體的亞顯微形態(tài)。

1.2.2.2 16S rRNA序列分析 試劑盒法提取細(xì)菌總DNA，16S rRNA通用引物（27F和1 495R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50 μL）為10×Buffer 5.0 μL;dNTPs 4.0 μL;27F 1.0 μL;1492R 1.0 μL;Taq酶0.5 μL;DNA模板2.0 μL;蒸餾水 36.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94 ℃ 5 min;變性94 ℃ 30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃維持10 min。

PCR產(chǎn)物送交北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，所得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行Blast分析比對(duì)。

1.2.3 淀粉酶活性的測(cè)定 3，5-二硝基水楊酸試劑顯色法測(cè)定淀粉酶活性[7]。以0.1 μL粗酶液，1 min水解淀粉產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U）。

1.2.4 菌株EPM產(chǎn)酶條件優(yōu)化 中心組合Box-Behnken優(yōu)化試驗(yàn)，pH值、溫度及鹽度為自變量，以淀粉酶活性為響應(yīng)值（Y），探討3個(gè)因素對(duì)淀粉酶活性的影響，試驗(yàn)因素與設(shè)計(jì)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株EPM的篩選

從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底泥中篩選到透明圈直徑較大的淀粉酶高產(chǎn)菌株EPM。由圖1可知，此菌株產(chǎn)生的淀粉酶活性較高，菌株菌落為白色、不透明、圓形、邊緣粗糙，生長過程中會(huì)產(chǎn)生抗生素藥物的氣味。

2.2 菌株EPM的鑒定

2.2.1 菌株的生理生化特征 菌株EPM的生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表2。菌株EPM能夠利用葡萄糖，不能利用乳糖，甲基紅與靛基質(zhì)試驗(yàn)為陰性，V-P試驗(yàn)為陽性，不產(chǎn)生硫化氫，不利用檸檬酸鹽，可還原硝酸鹽，能夠形成菌膜，為革蘭氏陽性菌。

2.2.2 菌株EPM的亞顯微觀察 由圖2可知，掃描電鏡下觀察，菌株菌絲呈多層纖維狀結(jié)構(gòu)，菌絲寬度為0.5～1.0 μm，有些會(huì)斷裂為短桿狀。

2.2.3 菌株EPM的16S rRNA序列分析 用DNA純化試劑盒對(duì)所提取的DNA進(jìn)行純化后，用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜如圖3所示。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將所得序列輸入GenBank中，與NCBI中Microbial Nucleotide Blast進(jìn)行比對(duì)，盧森坦擬諾卡氏菌（Nocardiopsis lucentensis）與此序列同源性最高，達(dá)99%。

結(jié)合以上EPM的菌落形態(tài)、菌株的亞顯微形態(tài)、菌株的生理生化特征及16S rRNA序列分析，確定篩選到的菌株為盧森坦擬諾卡氏菌。

2.3 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

按照表1設(shè)計(jì)方案進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

采用Design expert 7.0軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，二次回歸模型進(jìn)行擬合，回歸分析結(jié)果見表4、表5及表6。

P值小于0.05，表示該項(xiàng)指標(biāo)顯著，從表4可以看出，模型的P值小于0.05，說明該模型顯著，一次項(xiàng)中A、B的P值均小于0.05，說明它們對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，二次項(xiàng)中A2、B2、C2的P值均小于0.05，說明所選3個(gè)因素的二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響顯著。表4的P值表明，在所選定的各因素水平范圍內(nèi)，對(duì)響應(yīng)值的影響排序?yàn)闇囟?鹽度>pH值。

回歸模型中失擬項(xiàng)的P值大于0.05（表5），說明失擬項(xiàng)不顯著，所選模型與實(shí)際情況擬合程度高，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。

回歸模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.960 3，校正相關(guān)系數(shù)為 0.889 0（表6），達(dá)到了較好水平，說明模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值擬合較好，信噪比較大，說明這個(gè)模型能較好地反映試驗(yàn)結(jié)果。

最終擬合得到的二次回歸方程為Y=1.350 0-0.160 0A-0.140 0B+0.005 7C-0.100 0AB-0.089 0AC-0.096 0BC-0.600 0A2-0.290 0B2-0.330 0C2。

由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合，繪出響應(yīng)面分析圖，見圖4至圖6。

從圖4可以看出，隨著pH值和溫度的升高，酶活性也隨之增大，當(dāng)pH值和溫度升高到一定程度時(shí)，酶活性達(dá)到最大，pH值和溫度繼續(xù)升高時(shí)，酶活性又會(huì)隨之下降，說明pH值和溫度取某個(gè)適中值時(shí)，酶活性達(dá)到最大。同理，從圖5、圖6可以發(fā)現(xiàn)，pH值和鹽度、溫度和鹽度同樣對(duì)酶活性是非線性的，對(duì)酶活性同樣存在二次項(xiàng)。通過軟件優(yōu)化、模擬得到最佳產(chǎn)酶條件為pH值8.8、溫度39.19 ℃、鹽度60.32‰，預(yù)測(cè)的淀粉酶活性為1.332 U/μL， 經(jīng)3次驗(yàn)證試驗(yàn)， 實(shí)際測(cè)得淀粉酶活性為 1.356 U/μL?？紤]到操作的便利，將培養(yǎng)條件修正為pH值 8.8、溫度40 ℃、鹽度60‰，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)際測(cè)得淀粉酶活性為1.349 U/μL，驗(yàn)證試驗(yàn)和修正試驗(yàn)所得淀粉酶活性與理論值相差很小，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的產(chǎn)酶條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，模型具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

3 討論

擬諾卡氏菌是一種重要的資源微生物。一些學(xué)者在擬諾卡氏菌資源收集、生態(tài)學(xué)及天然產(chǎn)物等方面開展了較多研究工作，探索了擬諾卡氏菌地理分布格局、適應(yīng)極端環(huán)境機(jī)制，分離到多種化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富、活性新穎的新化合物，以及可降解淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素和木聚糖等生物大分子的具有耐冷、耐堿或耐熱等特殊性質(zhì)的酶[8-9]。筆者所在課題組從南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池底泥中篩選到1株高產(chǎn)淀粉酶菌株，經(jīng)過系列生理生化特征及16S rRNA序列分析，確定該菌株為盧森坦擬諾卡氏菌。

中度嗜鹽菌因其具有較大的鹽度適應(yīng)性，并應(yīng)用廣泛，引起了人們的極大關(guān)注。1978年，Kushner對(duì)中度嗜鹽菌定義為在0.5 mol/L（約3%）～2.5 mol/L（約15%）NaCl濃度之間有最佳生長的細(xì)菌[10]。1993年，Ramos-Cormenzana將中度嗜鹽菌定義為在5%～20%鹽度范圍內(nèi)能夠最佳生長的細(xì)菌[11]。中度嗜鹽菌在降解有毒化合物、環(huán)境污染治理等方面有重要的應(yīng)用前景[12-13];中度嗜鹽菌產(chǎn)生的酶如淀粉酶、核酸酶、蛋白酶等能夠抑制某些植物病原真菌，還可用于實(shí)際生產(chǎn)生活中[14]。

本研究從對(duì)蝦養(yǎng)殖池底泥中篩選到盧森坦擬諾卡氏菌，其淀粉酶活性達(dá)1 000 U/mL以上，高于芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)生的淀粉酶活性（293.8 U/mL）[15]，后者的最適鹽度為50‰，屬于中度嗜鹽菌。通過響應(yīng)面法，筆者所在課題組優(yōu)化了盧森坦擬諾卡氏菌的產(chǎn)酶條件，最適鹽度為60‰，pH值為8.8，說明該菌株在鹽度較高、堿度較大的環(huán)境中具有較好的淀粉酶產(chǎn)生能力，預(yù)示著該菌株在高鹽高堿的環(huán)境中具有較大的應(yīng)用前景，可應(yīng)用于工業(yè)、食品和污水處理等方面。

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