董波 李靜楠 曹雪珍

摘要：分析閩西地區(qū)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）N基因的遺傳進化特征，收集閩西地區(qū)豬流性腹瀉病例組織樣品8份，用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴增N基因，連接至pMD-18T載體進行測序，并與國內(nèi)外已知參考毒株序列進行比對及遺傳進化分析。結(jié)果顯示，8株閩西流行毒株之間N基因核苷酸的同源性為9.8%～100.0%，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為99.5%～100.0%，而閩西毒株與早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性較遠。氨基酸序列分析表明，閩西毒株氨基酸序列存在15處突變，與2010年后中國流行毒株變異位點相同。提示閩西地區(qū)毒株為目前國內(nèi)流行毒株，與疫苗毒株親緣關(guān)系較遠，可能導(dǎo)致機體針對疫苗毒株產(chǎn)生的抗體不能夠有效抵抗變異毒株，不能給豬群提供很好的免疫保護，因此需要基于變異毒株研究出有針對性的疫苗來預(yù)防PEDV。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;N基因;遺傳分析

中圖分類號： S852.65+1 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0059-04

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，簡稱PED）是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種高度接觸性傳染病，以腹瀉、嘔吐為主要臨床特征，冬、春季多發(fā)[1]。該病在世界大多數(shù)國家均有報道，尤其對韓國、中國、日本、菲律賓、泰國等亞洲國家造成了嚴(yán)重經(jīng)濟損失，引起養(yǎng)豬業(yè)的廣泛關(guān)注[2]。2010年末，我國暴發(fā)的PED影響了河北、安徽、廣西、廣東、浙江、江西、四川、湖南、福建等省份的養(yǎng)豬業(yè)[3]。此次疫情造成的損失慘重，甚至之前接種過豬流行性腹瀉病毒（PEDV）疫苗的豬群也同樣發(fā)病，究其原因，可能是由于流行毒株變異或者毒力增強，使現(xiàn)有疫苗難以提供免疫保護[4]。

豬流行性腹瀉病毒為冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，為單股正鏈RNA病毒，編碼2個復(fù)制酶多聚蛋白ppla和pplab，1個非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3和4個結(jié)構(gòu)蛋白纖突蛋白（spike，簡稱S）、膜蛋白（membrane，簡稱M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid，簡稱N）和小膜蛋白（small membrane，簡稱E）[5]。其中，N蛋白由1 326個核苷酸組成，編碼442個氨基酸。N蛋白是一種多功能磷酸化蛋白質(zhì)，能夠與細胞膜和磷脂結(jié)合，改變宿主細胞的轉(zhuǎn)錄，促使RNA復(fù)制體的形成和病毒組裝[6]。N基因在誘導(dǎo)免疫和病毒感染的致病機制中起重要作用，N蛋白的表達可抑制細胞RNA和蛋白質(zhì)G2/M期的合成從而促進病毒的繁殖[7]。在早期感染PEDV時，宿主體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白高水平的抗體，因此N蛋白可作為早期檢測發(fā)病豬是否感染PEDV的免疫靶細胞[8]。

近年來，PEDV的流行趨勢不斷增長，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的影響。因此，對PEDV的遺傳變異情況進行監(jiān)測是防控的重要環(huán)節(jié)。本研究收集閩西地區(qū)PEDV流行毒株，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴增N基因，將PEDV N基因序列進行同源性比較，繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，理清閩西地區(qū)PEDV與國內(nèi)外流行毒株以及疫苗毒株之間的遺傳進化關(guān)系，為做好PEDV的防控提供資料參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品選取2013年1月至2016年12月閩西地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場的PEDV陽性樣品8份。1.2 主要試劑

AxyPrep總RNA小量制備試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒、AxyPrep凝膠回收試劑盒，購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司;dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、5×M-MLV buffer、pMD18-T Vector，購自寶生物工程（大連）有限公司;DL2000 DNA marker、10×loading buffer，購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司;Oligo（dT）18、Murine RNase Inhibitor、T4 DNA Ligase、10×Ligase Buffer，購自南京諾唯贊生物科技有限公司;胰蛋白酶（tryptone）、酵母（yeast extract），購自O(shè)XOID公司;Ampicillin（氨芐西林）（100mg/mL）、NaCl、瓊脂粉，購自Biowest公司;異丙醇、三羥基甲基氨基甲烷（Tris堿）、溴化乙錠（EB）、三氯甲烷、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、DEPC（焦碳酸二乙酯）水，購自廣東省汕頭市西隴化工股份有限公司。

1.3 提取病毒總RNA及逆轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒提供的操作手冊，從試驗豬小腸組織及內(nèi)容物中提取總RNA。取潔凈EP管，加入RNA 11 μL、Oligo（dT）18 1 μL，12 000 r/min離心40 s，于70 ℃水浴10 min，加入 5×M-MLV Buffer 5 μL、M-MLV 1 μL、dNTP 1 μL、DEPC水6 μL，混勻后，42 ℃水浴30 min，95 ℃ 水浴10 min。cDNA于 -80 ℃ 下保存。

1.4 E基因的擴增

參考GenBank上已發(fā)表的PEDV毒株N基因序列，使用Premier Premier 5.0生物軟件設(shè)計合成1對特異性引物，PEDV-N-F：GGATCCATGGCTTCTGTCAGCTTTC;PEDV-N-R：CTCGAGTTTCAACGGCCGTATCACC。以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。使用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，觀察并記錄結(jié)果。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

采用AxyPrep凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物與pMD18-T Vector連接，16 ℃水浴4 h。將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒，進行鑒定。將陽性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.6 序列分析

8株閩西毒株分別命名為LY201301、LY201302、LY201401、LY201402、LY201501、LY201502、LY201601和LY201602。采用表1中標(biāo)準(zhǔn)毒株的基因庫登錄號，獲取參考毒株N基因序列。通過DNAstar和MEGA 5.2分子生物學(xué)分析軟件對8株閩西地區(qū)的PEDV N基因序列與國內(nèi)外已發(fā)表的毒株進行同源性分析，繪制PEDV基因系統(tǒng)遺傳進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 N基因的擴增、純化、克隆及測序

采用RT-PCR技術(shù)，對8份樣品的N基因進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定，由圖1可知，獲得大小約為1 326 bp的基因片段。將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列結(jié)果正確。

2.2 N基因的序列比對及同源性分析

閩西毒株N基因核苷酸序列之間的同源性為99.8%～100.0%，與26株引用毒株之間的同源性為94.3%～99.8%。閩西毒株與2010年以后中國分離毒株的同源性均在99%以上，與2013年美國毒株的同源性也均在99%以上。由圖2可知，經(jīng)遺傳進化分析，34株毒株可分成3大組，Ⅰ組包括疫苗株CV777、2株韓國毒株（Attenuated DR13和SM98）及6株早期中國毒株;Ⅲ組包括2013年分離的4株美國毒株、1株韓國毒株、2010年后分離的中國流行毒株以及8株閩西毒株。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，閩西毒株與經(jīng)典毒株CV777、2010年前中國分離毒株以及韓國毒株（Attenuated DR13和SM98）的親緣性較遠，與2010年以后中國分離毒株的親緣性較高，與2013年美國毒株的親緣性也較高，說明閩西毒株與目前國內(nèi)以及美國流行毒株可能來自同一祖先。

2.3 N基因的氨基酸結(jié)構(gòu)特征

由表2的序列比對結(jié)果可知，N基因全長為1 326 bp，編碼442個氨基酸，包含1個完整的閱讀框架。閩西毒株與疫苗毒株CV777相比，氨基酸序列僅存在15處突變。這些突變位置與2010年后的中國變異毒株一致。

3 討論

在PEDV的RNA合成過程中，N蛋白能與細胞膜磷脂結(jié)合，促進病毒的組裝和RNA復(fù)制體的形成[9]。另外，在PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白中，N蛋白所占比例最大，它能在感染的細胞中大量表達，并且在感染初期，動物體內(nèi)就能產(chǎn)生較高水平的抗N蛋白的抗體[10]。N蛋白具有高度保守的特性，可以作為早期診斷的靶蛋白，可利用N蛋白建立PEDV的分子生物學(xué)診斷技術(shù)[11]。因此，選擇N基因進行PEDV遺傳進化分析，有助于了解病毒的流行趨勢與進化規(guī)律，對于病毒的防控和疫苗的研制具有重要意義[12]。本研究收集8株閩西毒株，利用PCR擴增獲得8株病毒N基因，使用生物信息學(xué)軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，有助于從分子水平闡明閩西PEDV毒株與國內(nèi)外毒株的親緣關(guān)系。

同源性分析結(jié)果顯示，閩西毒株之間的核苷酸同源性為 99.8%～100.0%，與2010年后中國分離毒株的進化關(guān)系較近，說明閩西毒株與目前國內(nèi)流行毒株具有很高的同源性。然而，閩西PEDV流行毒株與疫苗毒株CV777的核苷酸同源性為94.0%～95.4%，遺傳進化關(guān)系較遠，提示以CV777為免疫原設(shè)計的疫苗，在防治PED方面可能作用不顯著，成為控制PEDV暴發(fā)的主要隱患。另外，閩西毒株與2013年美國流行毒株的同源性較高，親緣性較近，均屬于Ⅲ組，說明閩西流行毒株與2010年后中國分離毒株以及2013年后美國分離毒株可能來自同一祖先。并且由遺傳進化樹可見，早期韓國毒株（virulent DR13）也處于Ⅲ組，提示該毒株和目前國內(nèi)外流行毒株存在著潛在關(guān)系，需要進一步分析。8株閩西毒株N基因無特有的片段缺失和插入，存在15處相同突變，這些突變位點與2010年后中國分離毒株的突變位點一致，進一步證實了閩西毒株屬于2010年后中國流行毒株，也表明N基因相對保守，在目前國內(nèi)的流行毒株中基本沒有出現(xiàn)變異。

總之，本研究結(jié)果證實閩西PEDV毒株屬于目前國內(nèi)外的流行毒株，與疫苗毒株（CV777）的進化關(guān)系較遠，可能導(dǎo)致由CV777設(shè)計的疫苗對當(dāng)前流行毒株的保護力不夠，不能給豬群提供很好的免疫保護，因此需要設(shè)計有針對性的疫苗來預(yù)防PEDV。并且氨基酸序列分析表明，閩西毒株N基因與疫苗毒株CV777相比存在15處基因改變，但是與目前流行毒株相比沒有明顯變化，證明N基因是高度保守的，因而可以作為疫苗候選基因。本研究結(jié)果希望能從分子水平闡明閩西地區(qū)PEDV的遺傳進化特征，同時希望為PEDV疫苗的設(shè)計提供資料基礎(chǔ)。參考文獻：

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