王姣龍,諶小勇,2,4,閆文德,2,3,*

1 中南林業(yè)科技大學(xué),長沙 410004 2 南方林業(yè)生態(tài)應(yīng)用技術(shù)國家工程實驗室,長沙 410004 3 城市森林生態(tài)湖南省重點實驗室,長沙 410004 4州長州立大學(xué),伊利諾伊州 IL 60484

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的具有致癌、致畸、致突變性的持久性有機污染物,主要來源于人類活動,例如汽車尾氣、化石燃料不完全燃燒等[1],可通過大氣、水體、土壤和植物間的傳輸和交換而在整個環(huán)境中分布,并經(jīng)過食物鏈進入動物體和人體,直接威脅包括人類在內(nèi)的生命有機體的健康和安全[2]。因此,揭示PAHs在環(huán)境中的動態(tài)機制,加快對PAHs的清除速度,對于環(huán)境質(zhì)量改善和國土安全具有重要的現(xiàn)實意義。

添加模擬根系分泌物是一項很有發(fā)展前途的新型的PAHs污染土壤的生物修復(fù)技術(shù),其原理是通過調(diào)節(jié)和改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和活性促進PAHs的降解[3]。微生物降解土壤中的PAHs一般有兩種方式,一種是以PAHs為唯一碳源和能源；另一種是將PAHs與其他有機質(zhì)進行共代謝作用。據(jù)報道[4],根系分泌物中的一些低分子有機酸,比如琥珀酸和蘋果酸能夠有效促進吸附在土壤上的菲和芘的解吸,提高土壤中PAHs的有效性,從而加快PAHs的降解。土壤中有機質(zhì)含量越低,解吸作用越明顯。且不同分子量的外加碳源組分均在一定程度上縮短細菌對芘進入快速降解期的時間[5]。不同低分子有機酸對PAHs降解的影響作用不同,Wei等[6]發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)下,丁酸對混合PAHs(芴、菲、芘)降解效果優(yōu)于蘋果酸和檸檬酸,其主要是極性較弱的丁酸可優(yōu)化表面疏水性較強的分支桿菌與疏水性PAHs的接觸。

在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn),植物根系分泌物種類繁多。在PAHs脅迫下,根系分泌物中的物質(zhì)組成發(fā)生改變[7-8]。作為利用植物根系分泌物對PAHs污染土壤修復(fù)技術(shù)研究項目的一部分,本研究通過高通量Illumina Miseq技術(shù),重點研究根系分泌物中低分子有機酸對土壤中菲的降解過程,并探討添加低分子有機酸后菲污染土壤中細菌群落種類和數(shù)量的變化特征,揭示植物根系分泌物對PAHs污染土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響,以期為進一步研發(fā)PAHs污染環(huán)境下的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自于中南林業(yè)科技大學(xué)校園東園苗圃表層土壤(0—20 cm)。將供試土壤撿出根系、石塊等殘留物,自然風干后過2 mm篩子。采用酸度計測定土壤的 pH 值(水土比 5∶1)；采用島津總有機碳測定儀測定土壤總有機碳含量,采用凱氏蒸餾法測定土壤全N含量,采用硫酸-高氯酸消煮法測定土壤全P含量。經(jīng)測定,供試土壤的基本理化性質(zhì)：土壤pH值為5.40,土壤總有機碳含量為5.02 g/kg,土壤全N含量為0.13 g/kg,土壤全P含量為0.22 g/kg。

菲污染土壤的制備：選用菲(>97%,購于Sigma-Aldrich Co.)作為供試污染源,菲是PAHs中3個苯環(huán)的代表物,在環(huán)境中廣泛存在,是檢測PAH污染的指示物。將菲溶于丙酮后倒入供試土壤中均勻混合,制得2000 mg/kg水平的菲污染土壤,置于盆缽中平衡7 d后備用。

取500 g菲污染土壤盛裝于500 mL燒杯中,燒杯外壁裹上錫箔紙,模擬土壤黑暗狀態(tài),分別加入30 mL 0.16 mol/L乙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、混合有機酸(乙酸、檸檬酸、酒石酸及草酸的混合液)溶液,攪拌均勻后放置在溫室中,貼好標簽。同時設(shè)置對照處理,即在500 g污染土壤的燒杯中加入30 mL的去離子水,形成6種不同的處理：對照處理(K)、乙酸處理(Y)、檸檬酸處理(N)、酒石酸處理(J)、草酸處理(C)、混合有機酸處理(H)。每個處理有3個重復(fù)。實驗歷時180 d,實驗期間燒杯隨意擺放,每月將燒杯位置隨機移動一次,盡量使每個燒杯的微環(huán)境保持一致,室內(nèi)溫度因開窗對流基本與環(huán)境溫度保持一致。實驗分別于0、60、90、180 d后,采樣。

1.2 研究方法

土壤中菲的提取和凈化：取5 g制備好的土壤樣品于聚乙烯杯中,加入50 mL甲醇后,震蕩5 min,超聲20 min,4000 r/min離心25 min,取上清液過0.45 μm孔徑聚丙烯纖維濾膜,將稀釋液過SPE萃取柱,10 mL乙腈洗脫,取1 mL洗脫液過0.45 μm孔徑濾膜后上氣質(zhì)聯(lián)用儀分析。

氣質(zhì)聯(lián)用儀測定條件：流量1 mL/min,進樣口溫度230 ℃,接口溫度280,60 ℃→15 ℃/min→100 ℃(5 min)→8 ℃/min→210 ℃(3 min)→2 ℃/min→290 ℃(5 min)。

色譜柱為HP- 5毛細管色譜柱30 m×0.25 mm。不分流進樣,氣化溫度280 ℃,載氣為高純He。

細菌16S rRNA 基因高通量測序[9]：測序由上海美吉生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成,采用Illlumina Miseq系統(tǒng)進行雙向測序,采用引物515 F和907 R擴增細菌16S rRNA基因片段。測序所得結(jié)果,采用prinseq軟件對reads1、reads2的3端進行質(zhì)控,截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù),以提高后續(xù)序列融合比率。通過Flash 軟件融合雙末端序列,使其形成一條序列。采用prinseq軟件對各個樣品進行去引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列、低質(zhì)量序列。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)輸入整理及作圖采用Excel 2010軟件；采用SPSS 18.0對土壤理化數(shù)據(jù)進行方差分析、多重比較,使用R語言分析微生物多樣性數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下土壤中菲的降解過程

圖1 不同處理水平下土壤中菲降解Fig.1 Degradation of Phenanthrene in soil at different levels

由圖1可知,隨著時間的推移,對照組土壤中菲會自然降解,添加低分子有機酸對土壤中菲的降解有一定的促進作用,第0天土壤中菲含量均為571.46 mg/kg,第60天,菲含量降到了：210.70—340.39 mg/kg,降解率為：乙酸(63.13%)>檸檬酸(49.30%)>草酸(49.27%)>酒石酸(49.13%)>混合有機酸(43.28%)>對照(40.44%)；第90天,菲含量為：208.65—321.55mg/kg,降解率為：乙酸(63.49%)>檸檬酸(53.96%)>混合有機酸(51.83%)>草酸(51.72%)>酒石酸(50.45%)>對照(43.73%)。第180天,菲含量為：175.28—306.07 mg/kg,降解率分別為：乙酸(69.33%)>混合有機酸(57.41%)>草酸(56.15%)>檸檬酸(54.98%)>酒石酸(52.30%)>對照(46.44%)。用一級動力學(xué)方程對不同處理下菲降解過程進行了擬合(表1),結(jié)果表明,相較于對照,添加低分子有機酸的組分動力學(xué)常數(shù)增大,半衰期縮短,由動力學(xué)常數(shù)得出乙酸對菲降解的促進作用最為明顯。

表1 不同處理水平下菲的一級降解動力學(xué)方程

K：對照，Y：添加乙酸，N：添加檸檬酸，J：添加酒石酸，C：添加草酸，H：添加混合有機酸

2.2 菌群群落結(jié)構(gòu)組成

18個土壤樣品中細菌分布在12個門,24個綱,42個目,50個科,61個屬,61個種。序列中不能識別的分在其他組中。

在門分類水平下(圖2示),6個處理中,變形菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、裝甲菌門、GAL15、硝化螺旋菌門、Latescibacteria為優(yōu)勢門類,豐度占比90%以上。變形菌門是細菌中最大的一門,包括了假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等多種環(huán)芳烴降解菌屬,所有處理中變形菌門豐度均為最大,占所有組細菌門類的70.39%,添加低分子有機酸的組分中變形菌門豐度明顯高于對照組,其中乙酸組變形菌門豐度占比在第60天(71.57%)和第180天(93.46%)時最大,混合有機酸占比在第90天(93.7%)時最大(圖3示)。

圖2 門水平細菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.2 Bacteria community structure and distribution at phylum levelK：對照，Y：添加乙酸，N：添加檸檬酸，J：添加酒石酸，C：添加草酸，H：添加混合有機酸

圖3 不同時期變形菌門豐度分布圖 Fig.3 Distribution of Proteobacteria abundance at different stages

在屬分類水平下(圖4示),6個處理中,產(chǎn)黃桿菌屬(Rhodanobacter)、Fimicutes、Acidobacteria、Chloroflexi、Actinobacteria、Bacteroidetes、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Amatimonadetes、GAL15為優(yōu)勢菌屬,豐度占比90%以上。以豐度占比最大的產(chǎn)黃桿菌屬為例,產(chǎn)黃桿菌屬具有一定的多環(huán)芳烴降解能力[10],添加低分子有機酸的組分中產(chǎn)黃桿菌屬豐度明顯高于對照組(圖4示),第60天時檸檬酸組豐度占比(30.69%)最大,第90天時酒石酸組最大(49.37%),第180天時乙酸組最大(41.22%)。在第60天、第90天及第180天還檢測到了5種典型的菲降解菌,分別為：Bacillus[11]、鞘氨醇單胞菌屬[12]、Massilia[13]、Azospirillum[14]、Burkholderia-paraburkholderia[15]。5種典型菲降解菌均呈現(xiàn)出添加低分子有機酸組豐度占比高于對照組,且隨時間推移豐度占比升高。在第60天和第180天檢測到了一種PAHs降解菌紅球菌[11]。

2.3 菌群豐度變化和多樣性分析

OTU數(shù)是通過聚類操作得到的具有相似性的序列小組,可代表物種數(shù)目。由表2知,共檢測到648795條有效序列和565127個OTU。不同處理之間,OTU數(shù)量存在較大差異,第60天,對照組中OTU數(shù)明顯高于其他組,排序為對照>混合有機酸>乙酸>草酸>酒石酸>檸檬酸；第90天,排序為：草酸>檸檬酸>對照>乙酸>酒石酸>混合有機酸；第180天,對照>乙酸>混合有機酸>檸檬酸>草酸>酒石酸。不同采樣時間之間也存在差異,隨著時間推移土壤中總OTU數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢,分別為：60天(OTU總數(shù)為197084)>90天(184663)>180天(183380)。

表2 不同處理水平下的測序結(jié)果和豐度變化

對不同處理水平下的土壤進行Alaha多樣性分析,用Ace指數(shù)和Chao指數(shù)表示土壤中菌群豐度水平,用香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)表示菌群多樣性。結(jié)果顯示,在第60天、第90天和第180天,Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均呈現(xiàn)出對照組菌群豐度水平高于其他添酸組,香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)也顯示出對照組菌群多樣性高于其他添酸組,這說明添加低分子有機酸降低了菲污染土壤中細菌豐度及多樣性。在添加了低分子有機酸的組分中,第60天和第90天時酒石酸組細菌豐度及多樣性較高,第180天時混合有機酸組較高。

圖4 屬水平細菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.4 Bacteria community structure and distribution at genus level

圖5 不同時期產(chǎn)黃桿菌屬豐度分布圖Fig.5 Distribution of Rhodanobacter abundance at different stages

2.4 細菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

用主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)的方法鑒別不同處理中細菌群落結(jié)構(gòu)差異。由圖6示,在OTU水平下進行了主成分分析,在第60、90、180天,對照組與其他添加低分子有機酸的組分相關(guān)性不明顯。在第180天,添加草酸和檸檬酸組中OTU組成高度相似。其余不同時期不同組分之間相似度不高。

圖6 細菌群落的主成分分析Fig.6 Principal component analysis of bacterial community

2.5 細菌群落結(jié)構(gòu)的差異性分析

由圖7示,用Venn圖來表示不同時期細菌群落結(jié)構(gòu)的差異性。第60天、第90天、第180天測得的OTU種類數(shù)分別為：2680、2705、2542；其中共有OTU種類(1911),占3個時期總OTU種類數(shù)(3370)的56.71%；第60天、第90天、第180天獨有的OTU數(shù)分別為233(占總OTU種類數(shù)比例為6.91%)、292(8.66%)、199(5.91%)。第60天、第90天、第180天測得的屬種類分別為：530、560、540；其中共有屬種類(446),占3個時期總屬種類數(shù)(656)的67.99%,獨有的屬數(shù)分別為26(占總屬種類數(shù)比例為3.96%)、66(10.06%)、36(5.49%)。第60天、第90天、第180天測得的門種類分別為：31、33、28；其中共有門的種類(28),占3個時期總門種類數(shù)(35)的80.00%,獨有的門數(shù)分別為2(占總門種類數(shù)比例為5.71%)、4(11.42%)、0(0.00)。在門水平、屬水平和OUT水平下,第60天至第180天之間獨有種類數(shù)均呈現(xiàn)出先增長后下降的趨勢,說明了不同處理之間在第90天時細菌菌群差異性最大。

圖7 細菌群落結(jié)構(gòu)的Venn圖Fig.7 Venn drawing of bacterial community structure

3 討論與結(jié)論

目前,利用植物-微生物復(fù)合體系降解多環(huán)芳烴污染物已有一些報道[16],但植物根系分泌物對植物-微生物復(fù)合體系降解多環(huán)芳烴的影響研究較少。本研究驗證了添加根系分泌物促進了菲的降解,通過研究土壤中細菌群落特征,深入分析了根系分泌物降解菲的機理,為PAHs污染修復(fù)提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

菲污染土壤自身有一定的修復(fù)能力,但低分子有機酸對于土壤中菲的降解有明顯的促進作用。低分子有機酸促進土壤中多環(huán)芳烴的降解主要因為提供了碳源促進了多環(huán)芳烴降解菌的生長,不同低分子有機酸提供的碳含量存在差異,超過一定濃度時會對土壤中的微生物產(chǎn)生抑制作用[17],因此不同低分子有機酸對多環(huán)芳烴降解的促進作用不同。本研究中,通過計算一級動力學(xué)方程得出乙酸組對菲降解的促進作用強于其他組分,乙酸有應(yīng)用于土壤修復(fù)治理的潛力,這可能是由于菲降解菌對不同種類低分子有機酸利用率不同,也可能由于不同種類低分子有機酸對土壤理化性質(zhì)影響存在差異,添加低分子有機酸會導(dǎo)致土壤pH值降低,影響了土壤微生物群落結(jié)構(gòu),具體原因有待進一步分析。

通過高通量Illumina Miseq技術(shù)綜合評價了土壤細菌群落特征,得出從細菌群落結(jié)構(gòu)來看,土壤細菌的數(shù)量及其多樣性或許不是導(dǎo)致土壤菲降解的主要因素,反而特定的菲降解菌的豐度對菲降解有重要影響。這有可能是低分子有機酸僅為土壤中某些特定的微生物群落提供了碳源,促進了特定微生物的增長,并不一定會增加微生物總量及多樣性。王悅等[18]研究了三葉草根系分泌物對多環(huán)芳烴微生物降解及加氧酶的影響,得出三葉草根系分泌物促進了分枝桿菌M1加氧酶基因拷貝數(shù)的增長,卻未明顯引起16S rDNA基因數(shù)的增加。這說明了微生物數(shù)量及多樣性并不是反映微生物降解多環(huán)芳烴能力的敏感指標。添酸組中變形菌門豐度明顯高于對照組,且檢測到的5種典型的菲降解菌(分別為：Bacillus[11]、鞘氨醇單胞菌屬[12]、Massilia[13]、Azospirillum[14]、Burkholderia-paraburkholderia[15])的豐度占比在添酸組中明顯高于對照組,通過PCA分析也證明了對照組和其他添酸組的細菌菌群存在差異性?？赡苁且驗榉平到饩S度的增加促進了菲的降解,也可能與土壤理化性質(zhì)有關(guān),具體機制有待進一步研究。

添加低分子有機酸處理下不同時期土壤中細菌存在差異,隨著時間推移土壤中總OTU數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢,有可能是土壤中碳源隨時間減少,造成了土壤中OTU總數(shù)的減少。根據(jù)共代謝(Cometabolism)作用原理,也有可能是低分子有機酸的存在,增強了菲降解菌的酶活性,提高了菲降解菌對非生長基的降解效率。從細菌群落結(jié)構(gòu)Venn圖可以看出,添加低分子有機酸影響了PAHs污染土壤中細菌群落結(jié)構(gòu)組成,在第90天時細菌菌群差異性最大,這與眾多學(xué)者的研究結(jié)果一致[19-20],說明隨著時間推移,土壤中菲含量下降,引起了細菌多樣性先增長后下降的改變[21-22]。