丁 博 王志元 陳文銳 謝建軍 曾廣豐

（1 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 廣州 511436

2 廣州海關(guān)技術(shù)中心 廣州 510623）

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們健康意識的提高，食用保健食品來調(diào)節(jié)和改善人體功能成為更多人的選擇，保健食品行業(yè)也隨之迅速發(fā)展起來。截至2017年，我國批準(zhǔn)的保健食品共16 632種，其中國產(chǎn)保健食品15 880種，進(jìn)口保健食品752種[1]。2014年國內(nèi)保健品銷售總額已達(dá)到1 858億元，預(yù)計(jì)到2020年醫(yī)藥大健行業(yè)更會(huì)達(dá)到驚人的8萬億元，中國保健食品行業(yè)呈現(xiàn)高速發(fā)展的趨勢[2]。作為最具有投資價(jià)值的行業(yè)之一，保健品行業(yè)的監(jiān)管體系仍未完善，企業(yè)素質(zhì)參差不齊，保健食品檢出違禁藥物的事件屢有報(bào)道[3-4]。保健食品不以預(yù)防、治療疾病為目的。在各種保健食品中，調(diào)節(jié)血糖類、減肥類、抗疲勞類、增強(qiáng)免疫力類、改善睡眠類、降血壓類等功能保健食品的非法藥物添加問題比較嚴(yán)重。目前保健食品中非法添加藥品的總體狀況有以下4個(gè)特點(diǎn)[5]：（1）添加物來源不明；（2）非法添加藥物劑量隨意；（3）非法添加藥物的兼容性不明確；（4）藥物復(fù)合添加。2008年，南京市食品藥品監(jiān)督局曝光119種壯陽類的保健品違法添加西地那非類藥物[6]。2015年11月國家食品藥品監(jiān)督管理總局在市場上查獲31種假冒并涉嫌違法添加藥物成分的保健食品，其中檢出二甲雙胍、苯乙雙胍、格列苯脲、羅格列酮、西布曲明、西地那非、酚酞等違禁藥物[5]。國家食品藥品監(jiān)督管理局在2012年發(fā)布了《關(guān)于發(fā)布保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單（第一批）的通知》[7]，列出了6類保健品中可能添加的47種違禁藥物，然而這遠(yuǎn)不能涵蓋所有可能的非法添加物質(zhì)。由此可見，迫切需要建立保健食品中高通量違禁藥物篩查檢測方法。

QuEChERS最早由Anastassiades等[8]報(bào)道用來檢測蔬菜與水果中農(nóng)藥殘留，作為一種快速高效地前處理技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食品農(nóng)藥殘留檢測分析領(lǐng)域[9-11]。近年來，文獻(xiàn)報(bào)道采用QuEChERS技術(shù)提取分離大豆中異黃酮類化合物[12-13]，以及保健食品中違禁藥物的檢測[14-15]。文獻(xiàn)報(bào)道一些抗風(fēng)濕、哮喘及解熱鎮(zhèn)痛類中成藥物中非法添加抗炎、鎮(zhèn)靜安神類西藥成分[16-17]。由此推測，聲稱提高免疫力功能的保健食品可能非法添加此類藥物成分。本文研究對比分析溶劑提取法與QuEChERS前處理法提取保健食品中違禁藥物成分，依據(jù)IDA-MS技術(shù)獲得目標(biāo)物的高分辨質(zhì)譜信息，建立LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法檢測保健食品中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉、無水硫酸鎂（AR），廣州化學(xué)試劑廠；甲醇、乙腈（HPLC純），美國賽默飛世爾科技ThermoFisher Scientific公司；試驗(yàn)所用水由德國默克公司的Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)提供。標(biāo)準(zhǔn)品：醋酸可的松（Hydrocortisone acetate）、醋酸氫化可的松（Cortisone acetate）、醋酸潑尼松（Prednisone 21-acetate）、醋酸氫化潑尼松（Prednisolone acetate）、甲潑尼龍（Methylprednisolone）、氯氟美松（Clobetasol propionate）、曲安奈德（Triamcinolone acetonide）、醋酸氟輕松（Fluocinonide）、甲氧芐啶（Trimethoprim）、新諾明（Sulfamethoxazole）、安替比林（Antipyrine）、酮洛芬（Ketoprofen）、萘普生（Naproxen）、吲哚美辛（Indometacin）、哌唑嗪（Prazosin）、吡羅昔康（Piroxicam）、瑞格列奈（Repaglinide）、地塞米松（Dexamethasone）、阿普唑侖（Alprazolam）、氯硝西泮（Clonazepam）、地西泮（Diazepam）、勞拉西泮（Lorazepam）、硝西泮（Nitrazepam）、奧沙西泮（Oxazepam），德國Dr Ehrestorfor公司，純度大于98%。16個(gè)食品樣品購買于廣州某超市。

1.2 儀器與設(shè)備

TripleTOFTM5600高分辨質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司；Sartorius BT223S電子天平、Sartorius CPA225D 電子天平，德國Sartorius公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)，法國Merck Millipore公司；Sonoswiss SW30H超聲波清洗機(jī)、Transferpette 單道數(shù)字可調(diào)移液器（20～200 μL，200～1000 μL），德國 Brand公司。

1.3 分析方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精確稱量5.00～10.00 mg抗炎鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜安神類標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到單一標(biāo)準(zhǔn)母液。再根據(jù)計(jì)算結(jié)果，各取一定量母液至一個(gè)10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，搖勻。得到25 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，甲醇稀釋 10，25，50，100，200 μg/L和400 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 儀器分析條件 色譜柱：XBridge BEH C18 XP 色譜柱（2.5 μm，4.6 mm×100 mm），流動(dòng)相：A-0.1%甲酸，B-乙腈，梯度洗脫，初始 30%B，3 min升至40%，4 min升至70%，8 min升至80%，9 min升至100%，11 min保持100%，11.5 min降至30%，保持至13 min結(jié)束；流速0.5 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量 1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源：ESI和APCI復(fù)合源；掃描方式：正離子；APCI源：連接ABsciex公司自動(dòng)校正系統(tǒng)（CDS），每15個(gè)樣品自動(dòng)校正1次，校正液流速0.35 mL/min；氣簾氣：40 psi，霧化氣：50 psi，輔助氣：50 psi；離子源溫度：500 ℃；離子源電壓：5 500 V；一級TOF-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：100～1 000 u；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：100 ms；DP：100 V；CE：10 V；二級IDA-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：50～1 000 u；DP：100 V；CE：（35±15）V；高靈敏模式；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：50 ms；信號閾值：100 cps；IDA 實(shí)驗(yàn)每循環(huán)采集6次數(shù)據(jù)，動(dòng)態(tài)背景減法扣除。

所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)由ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集，數(shù)據(jù)在PeakView 2.0和MultiQuant 3.0軟件上進(jìn)行分析。使用峰面積進(jìn)行定量。

1.3.3 樣品前處理 QuEChERS法：片劑、沖劑、丸劑粉碎后混勻，膠囊剪開取內(nèi)容物，稱取0.500 g于50 mL聚丙烯離心管中，與0.25 g氯化鈉和1 g硫酸鎂混合，再加入凈化劑，然后加入15 mL 70%乙腈水溶液，搖勻，超聲處理15 min后以10 000 r/min，5 min離心，將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL具塞刻度試管，用70%乙腈定容至刻度線，搖勻，取約1 mL過0.22 μm有機(jī)濾膜待測。本試驗(yàn)選取空白（不加凈化劑）、50 mg C18、50 mg GCB、25 mg C18+25 mg GCB作為凈化劑，探究凈化劑對提取率的影響。

溶劑提取法：沖劑、丸劑粉碎后混勻，膠囊剪開取內(nèi)容物，稱取0.500 g樣品于50 mL聚丙烯離心管中，分別加入15 mL提取溶劑，超聲處理15 min。10 000 r/min，5 min離心后將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL具塞刻度試管，用相應(yīng)提取溶劑定容至刻度線，搖勻。取定容后的溶液約1 mL過0.22 μm有機(jī)濾膜待測。本試驗(yàn)選取80%甲醇-水溶液、50 mmol/L甲酸-80%甲醇-水溶液、80%乙腈-水溶液、50 mmol/L甲酸-80%乙腈-水溶液為提取溶劑，探究不同提取溶劑對目標(biāo)物提取的影響。

表1 定性定量分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table1 Mass fragmentation patterns of anti-inflammatory and sedative drugs

2 結(jié)果與分析

2.1 高分辨質(zhì)譜定性定量分析依據(jù)

利用IDA-MS高分辨質(zhì)譜技術(shù)檢測分析保健食品樣品中非法添加24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物，目標(biāo)違禁藥物一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和理論質(zhì)量與測得質(zhì)量誤差等信息見表1。

2.2 超聲輔助溶劑提取

參考研究報(bào)道利用甲醇、乙腈、酸化甲醇和酸化乙腈等溶劑提取復(fù)雜食品樣品基質(zhì)中目標(biāo)分析物[18]，本試驗(yàn)選擇80%甲醇、80%甲醇與50 mmol/L甲酸、80%乙腈和80%乙腈與50 mmol/L甲酸4種溶劑提取保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物成分，選擇固體藥片和魚油膠囊兩種樣品作為基質(zhì)考察對象（圖1），違禁藥物加標(biāo)質(zhì)量濃度是 50 μg/L。

由圖1a可知，4種溶劑對固體藥片基質(zhì)樣品中違禁藥物提取回收率差異不顯著，除了哌唑嗪之外，其它23種違禁藥物回收率均在80%以上。圖1b顯示4種溶劑提取方式對油狀膠囊樣品基質(zhì)中違禁藥物提取回收率差異顯著，80%乙腈與50 mmol/L甲酸溶劑提取回收率明顯高于其它3種溶劑，另外，油膠囊樣品基質(zhì)中哌唑嗪提取回收率也低于80%。結(jié)合兩種樣品基質(zhì)回收率考察結(jié)果，試驗(yàn)選擇80%乙腈與50 mmol/L甲酸溶劑提取保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物，并與QuEChERS前處理方法進(jìn)行對比試驗(yàn)。

圖1 溶劑萃取不同樣品基質(zhì)中違禁藥物的回收率Fig.1 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with solvent extraction in the different matrix samples

2.3 QuEChERS前處理

選擇固體藥片和油狀膠囊兩種樣品考察QuEChERS萃取違禁藥物的回收率情況，選擇C18、GCB等不同類型凈化劑，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。在無凈化劑、C18、GCB、GCB 與 C18等條件 QuEChERS前處理法提取固體藥片基質(zhì)保健食品中違禁藥物的回收率差異不顯著，其中甲潑尼龍（Methylprednisolone），氯氟美松（Clobetasol propionate）違禁藥物的回收率較低（圖2a）；油狀膠囊基質(zhì)保健食品樣品中違禁藥物在不同凈化劑條件下的回收率較為顯著，其中在C18凈化劑條件下，醋酸氫化可的松（Cortisone acetate），醋酸氫化潑尼松（Prednisolone acetate），甲潑尼龍（Methylprednisolone），氯氟美松（Clobetasol propionate），曲安奈德（Triamcinolone acetonide），醋酸 氟 輕 松（Fluocinonide），甲氧芐啶（Trimethoprim），新諾明（Sulfamethoxazole），安替比林（Antipyrine），酮洛芬（Ketoprofen），吲哚美辛（Indometacin），哌唑嗪（Prazosin），吡羅昔康（Piroxicam），瑞格列奈（Repaglinide），阿普唑侖（Alprazolam），氯硝西泮（Clonazepam），地西泮（Diazepam），勞拉西泮（Lorazepam），硝西泮（Nitrazepam），奧沙西泮（Ox-azepam）等違禁藥物的回收率較好（圖2b）。為此，試驗(yàn)選擇C18作為QuEChERS前處理方法的凈化劑，并與溶劑超聲輔助提取法比較。

圖2 QuEChERS前處理法提取違禁藥物的回收率Fig.2 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with the QuEChERS pretreatment in the different matrix samples

試驗(yàn)選擇80%乙腈與50 mmol/L甲酸溶劑超聲輔助提取法和C18凈化劑QuEChERS前處理方法提取固體藥片基質(zhì)樣品中違禁藥物的回收率情況，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。除了溶劑提取法萃取哌唑嗪低于80%之外，QuEChERS和溶劑提取方法提取違禁藥物回收率均在80%以上，QuEChERS法檢測24種違禁藥物回收率整體高于溶劑提取法，基于加標(biāo)回收率判斷標(biāo)準(zhǔn)，QuEChERS法與溶劑提取法萃取保健食品中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的回收率滿足檢測分析標(biāo)準(zhǔn)要求。因此，QuECh-ERS和溶劑提取法兩種前處理方法均滿足保健食品中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物檢測要求，試驗(yàn)選擇QuEChERS前處理與LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法檢測保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物。

2.4 方法線性范圍、檢測限與定量限

LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法檢測保健食品中24中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物，根據(jù)目標(biāo)分析物一級TOF-MS母離子精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級碎片離子IDA-MS精準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)及理論質(zhì)量數(shù)與測量質(zhì)量數(shù)誤差等信息，定性定量分析24種違禁藥物。QuEChERS法與溶劑提取法萃取保健食品中抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的回收率滿足檢測分析標(biāo)準(zhǔn)要求。因此，QuEChERS和溶劑提取法兩種前處理方法均滿足保健食品中對抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的檢測要求。以3倍信噪比對應(yīng)的濃度和10倍信噪比對應(yīng)的濃度確定24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。目標(biāo)分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限見表2。24違禁藥物線性范圍在2個(gè)數(shù)量級范圍之內(nèi)，相關(guān)系數(shù)在0.9990以上，檢測限在0.3～3 μg/L之間。

圖3 QuEChERS與溶劑提取法萃取違禁藥物的回收率Fig.3 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with the QuEChERS pretreatment and solvent extraction

表2 線性范圍、檢測限和定量限Table2 Analytical performance data of 24 anti-inflammatory and sedative drugs for linearity of calibration curves，coefficient of determination，LOD and LOQ

2.5 回收率

進(jìn)一步考察QuEChERS前處理技術(shù)與LCQ-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法測定保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的分析方法可行性與準(zhǔn)確性，試驗(yàn)選擇某膠囊狀保健食品樣品，做加標(biāo)回收率驗(yàn)證試驗(yàn)，在目標(biāo)物分析線性范圍內(nèi)，選取50 μg/L和150 μg/L兩個(gè)水平加標(biāo)濃度，每個(gè)濃度平行做3次，平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。24種違禁藥物50 μg/L加標(biāo)濃度水平的回收率在82.3%～94.4%之間，RSD為1.5%～8.4%，150 μg/L加標(biāo)濃度水平的回收率在81.8%～103%，RSD在0.8%～8.7%之間，試驗(yàn)結(jié)果顯示QuEChERS前處理技術(shù)與LC-Q-TOF-MS高分辨質(zhì)譜法適合保健食品中違禁藥物的檢測。

表3 加標(biāo)回收率Table3 The recoveries of 24 anti-inflammatory and sedative drugs

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測定保健食品中24種抗炎、鎮(zhèn)靜安神類違禁藥物的LC-Q-TOF-MS方法，試驗(yàn)優(yōu)化了QuEChERS與溶劑萃取前處理?xiàng)l件，利用IDA-MS高分辨質(zhì)譜技術(shù)分析目標(biāo)物，有效避免了樣品其它組分的基質(zhì)干擾，前處理方法簡單，檢測時(shí)間短，可快速檢測保健食品中違禁藥物成分。