劉佳　李巧君　王超　李凱　林雨青

摘?要?采用局域表面等離子體共振（LSPR）技術研究了金銀納米立方塊（Au@Ag NCs）與I2的反應過程，以Au@Ag NCs為探針，在暗場顯微鏡（DFM）下分析探針與不同濃度I/I2作用后的顏色比和散射光強度，發(fā)現(xiàn)探針顏色由藍色逐漸變?yōu)辄S綠色，同時其散射光強度不斷下降。此外，通過透射電鏡（TEM）和紫外?可見（UV?Vis）吸收光譜發(fā)現(xiàn)，Au@Ag NCs從邊緣不斷被氧化刻蝕，逐漸變成球形， 最終變成類球形。以Au@Ag NCs作為探針檢測I2，利用DFM檢測I2的線性范圍為0.1～50 μmol/L，檢出限為17 nmol/L，并將本方法應用于鼠腦透析液中I2的加標檢測，探究了Au@Ag NCs與I/I2之間的氧化還原反應過程。本研究為鼠腦透析液中I2的加標回收提供了一種新的高靈敏方法。

關鍵詞?金銀納米立方塊; 暗場顯微鏡; 散射強度; 碘

1?引 言

碘（I）是人體必須的微量元素之一，70%～80%的碘存在于甲狀腺中，是甲狀腺激素的重要組成部分。碘對大腦和神經系統(tǒng)的發(fā)育非常重要，在人體所需的營養(yǎng)中，對智力影響最為顯著的是碘元素，缺碘可能會造成小兒大腦發(fā)育異常，甚至不可恢復的智力殘疾。近年，化學催化、分析測定等領域與碘相關的研究報道較多[1～3]。有研究者發(fā)現(xiàn)，碘對金屬納米顆粒的形貌和形態(tài)控制有重要影響[4]，碘會通過吸附在納米顆粒的表面，降低納米顆粒的表面電勢， 誘導納米顆粒聚集[5～8]; 碘對納米顆粒的合成也有很好的調控作用， 如可誘導合成金三角 [9，10]; 有研究者利用碘對金納米顆粒腐蝕后仍然具有很好的生物相容性的性質，在金納米顆粒進入細胞之前先用碘腐蝕，可避免信號的干擾，并且還可達到對生物組織無傷害的效果[11]。盡管之前對碘的研究已經有很多，但主要碘元素與金納米顆?；蜚y納米顆粒的相互作用[12～16]， 對于碘與金銀納米方塊的研究很少，對活體腦中碘的檢測研究尚少。

近年來，貴金屬納米顆粒由于其小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應及其所具有的高度活躍的外層電子，具備獨特的光學性質， 局域表面等離子體共振（LSPR），受到廣泛關注。因為它們有很強的散射光，現(xiàn)已經被廣泛用于生物傳感和生物成像[17，18]、催化[19]、癌癥治療[20，21]和表面增強拉曼散射（SERS）等領域。當被特定頻率的入射輻射光激發(fā)時，金屬納米粒表面的自由電子發(fā)生集體振蕩，這導致其獨特的散射和吸收光學現(xiàn)象[22～25]。LSPR特征強烈依賴于納米粒子的材料、 形狀、 大小、 周圍的介電環(huán)境及粒子間的耦合作用[26～29]。與單金屬納米顆粒相比，核殼結構的雙金屬因為其結構的獨特性和尺寸易控性，近年備受關注。通過將不同貴金屬材料復合，可體現(xiàn)多種貴金屬材料的優(yōu)勢，同時也可通過金屬納米粒子之間的電磁耦合，調節(jié)納米粒子的局域表面等離子體共振特性。

本研究采用兩步法獲得金種子，用種子生長法合成金銀納米立方塊（Au@Ag NCs）。由于等離子體在Au和Ag表面的良好耦合，Au@Ag NCs具有更好的散射效率和吸收波長范圍; 合成的Au@Ag NCs有利于改善Ag NCs較差的水溶性，同時還能保持Ag NCs的高靈敏度[30，31]。利用暗場顯微鏡（DFM）成像技術對Au@Ag NCs的LSPR信號變化進行監(jiān)測，觀測了I2腐蝕Au@Ag NCs的過程，如圖1所示。實驗結果表明，隨著碘的加入，探針散射光的強度不斷下降，同時散射光的顏色由藍色變?yōu)辄S綠色。 紫外?可見吸收技術以及TEM等表征結果證明， Au@Ag NCs與I/I2之間的反應是從頂點被蝕刻并逐漸轉變?yōu)榍蛐?，最終變?yōu)轭惽蛐巍Ｓ捎贏u@Ag NCs的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，導致了其LSPR性質的變化。最后以Au@Ag NCs為探針，利用DMF可在0.1～50 μmol/L線性檢測I2，并成功用于鼠腦透析液中加標檢測I2。本研究為I2的檢測提供了一種新技術，有望在相關生物檢測研究中得到應用。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

UV?2550紫外?可見分光光度計（日本島津公司）。 JEM?2100F透射電子顯微鏡（日本捷歐路公司）。 尼康 80i光學顯微鏡（日本尼康公司），油浸暗場聚光器（數(shù)值孔徑1.20～1.43），60× Plan Fluor物鏡，TGBS（每毫米70個槽，Edmund Optics）組成，一臺CoolSNAP HQ2 CCD相機（最佳光譜響應窗口為470～630 nm，量子效率為460%，Roper Scientific）和一臺Olympus DP72彩色CCD相機。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，>98.0%）、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC，>98.0%）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、 L?抗壞血酸（BioUltra，≥99.5%）、AgNO3（>99%）和 NaBH4（99%）購自Sigma?Aldrich公司。KI、 I2、NaOH、檸檬酸鈉和其它化學品購自北京化學試劑公司。所有試劑均未經過純化，直接使用。實驗用水為Milli?Q系統(tǒng)（美國Millipore公司）生產的超純水（18.2 MΩ·cm）。以王水清洗所有玻璃器皿，用水徹底沖洗，并在使用前干燥。

2.2?Au@Ag核殼納米立方塊制備

2.2.1?金種子溶液的制備?采用兩步法制備Au@Ag核殼納米立方體[32]。首先向含有HAuCl4（0.25 mmol/L）和CTAB（100 mmol/L）的10 mL溶液中加入0.6 mL冰冷的NaBH4溶液（10 mmol/L），溶液顏色變?yōu)楹稚?，制備直徑? nm 的金納米種子溶液。將種子溶液在27°C孵育3 h，以確保NaBH4完全分解并留在溶液中。

2.2.2?CTAC封端的金種子的制備?將6 mL HAuCl4溶液（0.5 mmol/L）、6 mL CTAC溶液（200 mmol/L）和4.5 mL AA溶液（100 mmol/L）混合，然后加入0.3 mL 3 nm金種子溶液。最終混合物在1 min內從無色變?yōu)榧t色，表明形成較大的金納米晶體。靜置1 h， 14500 r/min離心 30 min，收集產物，用水洗滌1次，記錄UV光譜。將納米晶體分散在4 mL去離子水中，使得種子溶液中金的濃度約為0.146 g/L。

2.2.3?Au@Ag納米立方塊的制備?將0.5 mL CTAC 封端的金種子溶液和4.5 mL CTAC （20 mmol/L）溶液混合在20 mL燒瓶中。將混合物在磁力攪拌下60℃加熱20 min，同時注入特定體積的AgNO3溶液（2 mmol/L）、 AA溶液（50 mmol/L）和CTAC（40 mmol/L）， 注射泵的速度為0.2 mL/min。加入反應溶液中的AA（50 mmol/L）體積保持與AgNO3相同，均為0.5 mL。注射后，最終溶液中AgNO3的濃度為0.17 mmol/L。在注射期間，反應混合物從紅色變?yōu)樽攸S色。繼續(xù)反應4 h后，所得到的材料用冰浴淬滅， 14500 r/min離心15 min， 收集產物，然后用水洗滌1次。

3?結果討論

3.1?金銀納米顆粒合成過程的形貌和吸收光譜表征

采用種子生長法獲得Au@Ag NCs。利用NaBH4還原HAuCl4合成金納米晶[32]，TEM圖像如圖2A所示。球形金納米晶約為3 nm; 在HAuCl4、AA和CTAC存在下，3 nm的金納米晶生長成11 nm的金納米晶（圖2B）。圖2C為Au@Ag NCs的TEM圖像，顆粒大小約為（46.7±2.3） nm，其中粒徑在40.0～47.5 nm之間的Au@Ag NCs約占90%（圖2C插圖），這與～50 nm顆粒具有優(yōu)異的LSPR效應是一致的[33]。圖2 D為3 nm金納米晶（曲線1）、11 nm金納米晶（曲線2）和Au@Ag NCs（曲線3）的紫外?可見吸收光譜，3 nm金納米晶體的吸收峰為293 nm，與文獻[32]結果相符。吸收峰相對較窄，說明其粒徑相對均勻，TEM結果也證實了這一點。此外，合成的11 nm金納米晶的吸收峰為512 nm。Au@Ag NCs的吸收峰值在451 nm處，這與Ag殼層的形成有關，Ag殼屏蔽效應導致峰值位置發(fā)生藍移。以上結果初步證實本實驗成功制備了Au@Ag NCs。

3.2?Au@Ag NCs的HRTEM形貌表征

對制備的材料進行了高分辨透射電鏡表征。在Au@Ag NCs高分辨透射電鏡圖（圖3A）中可見到明顯的核殼結構。用X射線能譜元素像分析技術（EDS?mapping）表征了Au@Ag NCs表面的元素組成，用藍色標記Au存在的區(qū)域 （圖3B），用紅色標記Ag存在的區(qū)域 （圖3C）。從圖3D可見，合成的Au@Ag NCs有明顯的核殼結構， 并且表面存在的金元素和銀元素分布均勻。從圖3E可清楚地觀察到所合成納米顆粒表面銀的晶格，晶格對應為面心立方Ag （200） 晶面，表示成功制備了金銀核殼納米立方結構。同時，對Au@Ag NCs的X射線能譜數(shù)據進行了分析（圖3F）。 結合前面的分析可知，本研究成功制備了Au@Ag NCs。

3.3?Au@Ag NCs與不同濃度I/I2的相互作用的暗場光散射成像

Au@Ag NCs與I/I2反應后，LSPR散射光發(fā)生變化，導致暗場顏色發(fā)生變化。Au@Ag NCs與不同濃度的I/I2反應后， 暗場顏色的變化如圖4所示，有大面積暗場散射，合成的Au@Ag NCs為藍色，因為Ag殼層較厚，阻擋了Au的光散射信號。由于納米粒子散射光的顏色與納米粒子的大小有關，因此這進一步表明合成的納米粒子大小均勻。圖4B～4F為添加不同濃度I/I2后Au@Ag NCs大面積暗場散射圖像（0、0.1、0.5、1、10和50 μmol/L）。 加入I/I2溶液后，Au@Ag NCs在暗場中的散射光先變?yōu)榱咙S色，然后逐漸變暗，說明I2與Ag殼層發(fā)生反應。AgI改變了探針表面的物理化學性質，所以散射光的顏色發(fā)生了變化。但隨著I/I2濃度的進一步增加，Au@Ag NCs進一步被腐蝕，AgI不斷沉積在Au@Ag NCs表面，導致散射光強度減弱，散射光顏色也不斷發(fā)生變化。這為探索Au@Ag NCs與I/I2的反應過程提供了一種更直觀、更快、更簡單的新方法。

光學成像技術已被廣泛運用于多個領域，如在細胞或組織水平上可視化和確定生物結構[17]。目前，研究者已提出了幾種描述各向異性納米粒子的光學性質的數(shù)值方法，包括離散偶極子近似法，時域有限差分法、有限元法和多重多極法[34～39]。使用這些數(shù)值方法模擬各向異性納米顆粒的光學響應通常非常復雜和耗時。即使對于簡單的各向異性納米結構，如橢球狀納米棒，也不能直接揭示光學性質對其形狀的依賴性。所以，本研究采用顏色比例法分析Au@Ag NCs納米顆粒的光學響應信號，B表示藍色，G表示綠色， Y表示黃色。如圖4G所示，隨著I/I2濃度增加，藍色占比逐漸下降，黃色占比逐漸上升，綠色變化比較平緩。進一步分析得到黃光顏色占比I/I2濃度之間的關系（圖4I），其線性關系如圖4J所示，得到檢測范圍為0.1～50.0 μmol/L，線性方程為y=4.47x+42.56 （R2=0.972）， 檢出限達到17 nmol/L。上述結果進一步證明Au@Ag NCs被刻蝕的程度與I/I2濃度有關。

在對顏色進行分析的同時，本研究還對光信號強度進行了分析。 隨機選取3張I/I2濃度的暗場原圖片，在每張圖中隨機選取約100個粒子，利用Image J提取其散射光強度信息，再分別計算，統(tǒng)計出其散射光強度的變化值。如圖4H所示，隨著I/I2濃度增加，其散射光強度先增加后逐漸降低，原因可能是先加入少量的I/I2， Au@Ag NCs的大小未發(fā)生明顯變化，而表面被氧化形成AgI外殼，顆粒折射率發(fā)生變化，所以散射光強度先增加;然而，隨著I/I2的濃度逐漸增大，Au@Ag NCs逐漸被氧化刻蝕，粒徑減小，散射光強度逐漸降低。當加入I/I2濃度超過10 μmol/L時，散射光強度幾乎不再發(fā)生變化。這可能是因為Ag殼表面的活性位點有限，導致反應無法進一步進行。

3.4?Au@Ag NCs納米顆粒與I/I2的反應前后TEM表征研究了Au@Ag NCs與I/I2相互作用的暗場成像特性。為進一步探討Au@Ag NCs與I/I2之間的相互作用，采用TEM對合成的納米粒子進行表征。如圖5所示，在添加I/I2前，Ag殼相對較厚，Au核相對較小，因此，在上述暗場成像中，Au@Ag NCs的散射光呈藍色。加入I/I2后，Au@Ag NCs的散射光由藍色逐漸變?yōu)辄S綠色，與納米粒子的形貌變化相對應。Au@Ag NCs的形貌變化從立方體的各個角逐漸圓滑，最終變成球形，再進一步與I/I2反應，形貌最終變成類球形。從圖5A～5C可見，隨著I/I2對銀殼層的不斷腐蝕，Au@Ag NCs的尺寸略有增加，這是因為I2被還原成AgI沉淀，并沉積在納米顆粒上。此外，隨著I/I2濃度增加，在不斷被刻蝕的過程中，Au@Ag NCs形狀不斷變化，最終形成類球形，這可能由于I2與Ag殼層過度反應形成AgI，從而導致其與Au核分離[40]。

3.5?Au@Ag NCs納米顆粒與I/I2作用后TEM表征對刻蝕后的Au@Ag NCs進行了高分辨透射元素表征和EDS?mapping表征（圖6）。本研究用綠色標記Ag元素存在的區(qū)域 （圖6B），用黃色標記Au元素存在的區(qū)域 （圖6C），用紅色標記I元素存在的區(qū)域 （圖6D）。從圖6E可見，合成的納米顆粒保留有明顯的核殼結構，并可很清楚地看到I元素覆蓋在Ag殼表面， 表明合成的Au@Ag NCs顆粒被I/I2氧化刻蝕。由圖6F可知反應后Au、Ag的含量。結合前面的分析，可得出Au@Ag NCs顆粒逐漸被I/I2氧化刻蝕，從TEM圖可清楚地看出氧化刻蝕位置是從Au@Ag NCs顆粒的頂點開始氧化，逐漸刻蝕為球形，對應在暗場的表現(xiàn)為散射光強度逐漸降低，散射顏色由藍色變?yōu)辄S綠色。

3.6?Au@Ag NCs與I/I2的相互作用紫外光譜分析

圖7是Au@Ag NCs與不同濃度的I/I2反應的紫外可見光譜和照片。隨著I/I2濃度增加，顏色由亮黃色變?yōu)榛疑?，說明I/I2與探針材料發(fā)生了反應。此外，峰位由450 nm逐漸紅移至600 nm。眾所周知，藍光的吸收波長約為450～435 nm，綠光的吸收波長范圍約為577～ 492 nm，黃光的吸收波長范圍約為597～577 nm。紫外?可見光譜顯示，Au@Ag NCs與I/I2反應后，散射光由藍色逐漸變?yōu)辄S綠色，與上述暗場數(shù)據完全吻合。紅移的原因可能是Au@Ag NCs在加入I/I2后發(fā)生團聚。

3.7?實際樣品中碘濃度的檢測

為了考察Au@Ag NCs檢測實際腦透析液中I2的可行性，在鼠腦透析液中添加I2進行測試。在鼠腦透析液中加入Au@Ag NCs，其紫外?可見吸收光譜未發(fā)生紅移，說明鼠腦透析液中未檢出I2。在鼠腦透析液中加入不同濃度的I/I2（0.5、1、2、5和10 μmol/L），結合UV?Vis確定I/I2在鼠腦透析液中的回收率（表1）。本研究設計的Au@Ag NCs探針靈敏度高，可用于鼠腦透析液中I2的加標檢測。

4?結 論

采用局域表面等離子體共振（LSPR）技術研究了Au@Ag NCs與I/I2的反應過程。探針與不同濃度I/I2作用后，顆粒散射光的顏色和強度發(fā)生了變化，可得到相應的I2檢測定量信息，檢出限為17 nmol/L。DFM和TEM結果證實了散射光與Au@Ag NCs形貌之間的關系，證實了等離子體共振散射峰移動與Au@Ag NCs形貌變化之間的關系。結合反應前后Au@Ag NCs的形貌、紫外?可見光譜和表面元素分析，得到了Ag殼層與I/I2溶液反應后形成了Ag@AgI納米粒子。本研究揭示了Au@Ag NCs與I/I2相互作用過程，有助于研究Au和Ag納米粒子的氧化腐蝕過程， 并將此氧化還原反應成功應用于鼠腦透析液中I2的加標檢測。

References

1?Shen Y W， Hsu P H，Unnikrishnan B， Li Y J， Huang C C. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2014， 6： 2576-2582

2?Cho E C，Xie， J， Wurm， P A， Xia Y N. Nano Lett.， ?2009， ?9： 1080-1084

3?Langille M R， Personick M L， Zhang J， Mirkin C A. J. Am. Chem. Soc.， ?2012， ?134： 14542-14554

4?Wang J， Li Y F， Huang C Z. J. Phys. Chem. C， ?2008， ?112： 11691-11695

5?Boal A K， Ilhan F， DeRouchey J E， Thurn?Albrecht T， Russell T P， Rotello V M. Nature， ?2000， ?404： 746-748

6?Mirkin C A， Letsinger R L， Mucic R C， Stohoff J J. Nature， ?1996， ?382： 607-609

7?Cheng W L， Dong S J， Wang E. Angew. Chem. Int. Ed.， ?2003， ?42： 449-452

8?Jiang Y， Zhu G， Lin F，Zhang H， Jin C H， Yuan J， Yang D， Zhang Z. Nano Lett.， ?2014， ?14： 3761-3765

9?Smith J G， Yang Q， Jain P K. Angew. Chem. Int. Ed.， ?2014， ?53： 2867-2872

10?Waldeisen J R， Wang T， Ross B M， Lee L P. ACS Nano， ?2011， ?5： 5383-5389

11?Lei G， Gao P F， Liu H， Huang C Z. Nanoscale， ?2015， ?7： 20709-20716

12?Shi L， Jing C， Ma W， Li D W， Halls J E， Marken F， Long Y T. Angew. Chem. Int. Ed.， ?2013， ?52： 6011-6014

13?Cui M， Liu R， Deng Z Y， Ge G L， Lin Y， Xie L M. Nano Res.， ?2014， ?7： 345-352

14?Jing C， Rawson F J， Zhou H， Shi X， Li W H， Li D W， Long Y T. Anal. Chem.， ?2014， ?86： 5513-5518

15?Zhang C Y，Yeh H C， Kuroki M T， Wang T H. Nat. Mater.， ?2005， ?4： 826-831

16?Hurst S J， Payne E K， Qin L， Mirkin C A. Angew. Chem. Int. Ed.， ?2006， 45： 2672-2692

17?Xiong B， Cheng J， Qiao Y X， Zhou R， He Y， Yeung E S. J. Chromatogr. A， ?2011， ?1218： 3823-3829

18?Homola J. Chem. Rev.， ?2008， ?108： 462-493

19?Jiang H L， Akita T， Ishida T， Haruta M， Xu Q. J. Am. Chem. Soc.， ?2011， ?133（5）： 1304-1306

20?Vo?Dinh T， Allain L， Stokes D. J. Raman Spectrosc.， ?2002， ?33： 511-516

21?Li Y， Lee H J， Corn R. Anal. Chem.， ?2007， ?79： 1082-1088

22?Willets K A， Duyne R P V. Annu. Rev. Phys. Chem.， ?2007， ?58：267-297

23?Mie G. Ann. Phys.， ?1908， ?25： 377-445

24?N'Gom M， Ringnalda J， Mansfield J F， Agarwal A， Kotov N， Zaluzec N J， Norris T B. Nano Lett.， ?2008， ?8： 3200-3204

25?Moon J H， Kim K H， Choi H W， Lee S W， Park S J. Ultramicroscopy， ?2008， ?108： 1307-1310

26?Jensen T R， Malinsky M D， Haynes C L， Duyne P V. J. Phys. Chem. B， ?2000， ?104 ：10549-10556

27?Jensen T R， Duval M L， Kelly K L， Lazarides A A， Schatz G C， Duyne P V. J. Phys. Chem. B， ?1999， ?103： 9846-9853

28?Kelly K L， Coronado E， Zhao L L， Shatz G C. J. Phys. Chem. B， ?2003， ?107： 668-677

29?Willets， K A， Van Duyne R P. Annu. Rev. Phys. Chem.， ?2007， ?58： 267-297

30?Zhang L， Zhang Y， Hu Y， Fan Q， Yang W， Li A， Li S， Huang W， Wang L. Chem. Commun.， ?2014， ?51， 294-297

31?Zhang Q， Li W， Moran C， Zeng J， Chen J， Wen L， Xia Y. J. Am. Chem. Soc.， ?2010， ?132（32）： 11372-11378

32?Zhang L， Zhang J， Wang F， Shen J， Zhang Y， Wu L， Lu X， Wang L， Fan Q， Huang W. RSC Adv.， ?2018， ?8： 5792-5796