夏 憶，盧建遠(yuǎn)，何向東，陳 瑩，字向東

(西南民族大學(xué)動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及周邊地區(qū)特有畜種，分布于海拔2 500 ～5 500 米高寒、低氧、干燥、輻射強(qiáng)的極端環(huán)境中，是青藏高原人們賴以生存的重要畜種[1-2]，我國(guó)擁有1 400 萬(wàn)余頭牦牛，占世界總量95%以上.牦牛是季節(jié)性發(fā)情畜種，發(fā)情期為7 月至10 月中旬，妊娠期為250 ～260 天，通常兩年一胎或三年兩胎，高產(chǎn)者在整個(gè)生命周期中也僅能繁殖4 ～5頭，繁殖率較低，制約著牦牛的良種繁育及高原畜牧業(yè)發(fā)展[3-5].

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶，簡(jiǎn)稱半胱天冬酶( Aspartate - specific cysteinyl proteinase，Caspase)，能特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵，活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸殘基[6].Caspase 家族按功能分為兩類(lèi)，一是起始子：Caspase -8、Caspase -9、Caspase-10 等，主要功能為識(shí)別L -E -X -D 序列或V-E-X-D 序列[7]，使Caspase 最初以無(wú)活性酶原的形式存活于細(xì)胞中，在受到凋亡誘導(dǎo)的信號(hào)刺激后被激活，與胞膜受體或細(xì)胞內(nèi)的促凋亡相關(guān)因子結(jié)合，使起始分子聚集并相互切割，活化后的起始子再切割下游效應(yīng)Caspase；另一類(lèi)是效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，主要作用是識(shí)別天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸(D-E -VD)序列，作為上游Caspase 的底物，活化后作用于胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)或酶[7-8].Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Caspase-3 處在蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)最核心的位置，是最重要的凋亡執(zhí)行者[9]. 一旦細(xì)胞接受凋亡刺激，上游不同Caspase 蛋白酶切割Caspase - 3 酶原，活化后的Caspase-3 與底物反應(yīng)，能使百余種蛋白水解，造成細(xì)胞染色質(zhì)濃縮和DNA 片段化[10-12]. 在基因敲除Caspase-3 的小鼠中發(fā)現(xiàn)，與凋亡有關(guān)的形態(tài)學(xué)變化如染色質(zhì)凝集、線粒體腫脹、細(xì)胞皺縮等都明顯延遲甚至缺乏[13-14].

目前Caspase-3 基因在牦牛上的研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)克隆牦牛Caspase -3 基因CDS 序列，檢測(cè)比較牦牛與黃牛生殖軸Caspase-3 基因的表達(dá)，為研究Caspase-3 對(duì)生活于高寒、低氧、強(qiáng)輻射等極端環(huán)境條件下的牦牛生殖調(diào)控中的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

2017 年9 月，選取4 ～5 周歲、健康、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的牦牛與黃牛各5 頭，采集組織，洗凈后保存于液氮中.

1.2 主要試劑

Trizol、RevertAidTMFirst Stand c DNA°Synthesis 試劑盒、DreamTaq Green PCR Master Mix(2 ×)、PowerUp TMSYBRTM Green Master Mix 均購(gòu)自賽默飛世爾中國(guó)公司；PCR 八聯(lián)管購(gòu)自Bio-Rad 公司.

1.3 方法

1.3.1 總RNA 提取和模板制備

取牦牛、黃牛各組織，按Trizol 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA抽提，并以提取的RNA 為模板，合成cDNA 第一鏈.

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

根據(jù)黃牛Caspase-3 基因(XM_010820245.3)序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR 特異性引物(表1)，以5 頭牦牛卵巢cDNA 第一鏈為模板，擴(kuò)增牦牛Caspase -3 基因. PCR 擴(kuò)增體系25 μL：ddH2O 9.5 μL、上下游引物、cDNA 各1 μL，2 ×Taq PCR Master Mix 12.5 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸15 min，4 ℃保存.

1.3.3 牦牛Caspase-3 基因生物信息學(xué)分析

使用ORF 在線程序(https：/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找序列開(kāi)放閱框[2]；BLAST(https：/ /blast.ncbi.nlm. nih. gov/Blast. cgi)進(jìn)行序列比對(duì)；ProtParam(https：/ /web.expasy.org/protparam)進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)分析；ProtScal(http：/ /expasy.org/tools/protscale.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測(cè)[15]；Signal P4.0(http：/ /www. cbs. dtu. dk/services/Signal P/)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)；PredictProtein(https：/ /predictprotein.org/home) 和SWISSMODEL(https：/ /swissmodel. expasy.org)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等[16].

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)Caspase -3 和內(nèi)參基因GADPH (EU195062.1)特異性熒光定量引物(表1)，反應(yīng)總體系為15 μL：ddH2O 5.5 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA1 μL、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 7.5 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共39 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3 次，并設(shè)置陰性對(duì)照.

表1 牦牛Caspase-3 基因引物序列Table 1 Primers used for yak Caspase-3 gene

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 軟件，2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)對(duì)同組織不同物種表達(dá)差異進(jìn)行比較，采用單因素差異顯著分析對(duì)同物種不同組織表達(dá)差異進(jìn)行比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，當(dāng)P＜0.05 時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 提取

將Trizol 法抽提的RNA 進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，并用儀器檢測(cè)OD 值(圖1)，結(jié)果顯示：5S、18S和28S 的RNA 完整，且條帶明亮單一無(wú)彌散現(xiàn)象；OD 值界于1.9 ～2.0 之間，說(shuō)明成功提取未污染、完整的RNA，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求.

圖1 總RNA 檢測(cè)1，2，3：黃牛RNA；4，5，6：牦牛RNA

2.2 Caspase-3 序列分析

通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，得到產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期相同，為長(zhǎng)度963 bp 的條帶(圖2).獲得牦牛Caspase-3 基因開(kāi)放閱讀框834 bp，編碼277 個(gè)氨基酸.其中，A=33.1%、T=26.9%、C=18.4%、G=21.6%；A+T=60.0%、C +G =40.0%，存在一定堿基偏好. 與黃牛相比，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)堿基突變，第354 位C→T，第399 位T→C，皆為沉默突變；而第659 位C→T，造成氨基酸改變Ala→Val；第678 位T→A，造成氨基酸Asn→Lys，將序列提交至NCBI，得到登錄號(hào)：MK291254.

2.3 Caspase-3 蛋白分析

牦牛Caspase-3 蛋白分子式為C2546H4260N834O1059S154，分子質(zhì)量為68436.02，由Ala(33.1%)、Cys(18.5%)、Gly(21.6%)與Thr(26.8%)組成.理論等電點(diǎn)為5.14；不穩(wěn)定指數(shù)為43.95，半衰期為4.4h，推測(cè)是酸性不穩(wěn)定蛋白；根據(jù)ProtScal 預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，牦牛Caspase-3 蛋白在第111 位氨基酸處有最小值，為-2.7；在第118 位氨基酸處有最大值，為2.133，親水殘基數(shù)大于疏水殘基數(shù)，且蛋白質(zhì)平均親水系數(shù)為0.783，推測(cè)為親水蛋白；根據(jù)SignalP4.0 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示牦牛Caspase-3 蛋白C(0.109)峰值在53 位氨基酸上，Y(0.104)峰值在53 位氨基酸上，S(0.107)峰值在37 位氨基酸上，綜合判斷，蛋白不存在信號(hào)肽，為非分泌蛋白；根據(jù)TMPRED 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，蛋白無(wú)跨膜區(qū)域.

Caspase-3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，該蛋白包括無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β -轉(zhuǎn)角4 部分，分別占據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)的50.18%、29.24%、15.16%、5.42%(圖3).SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)成分預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致.蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，牦牛Caspase -3 具有CASc 家族典型結(jié)構(gòu)域，在39 ～277 位氨基酸有特異結(jié)合位點(diǎn)，是CASc 超家族成員(圖4).

圖2 Caspase-3 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of Caspase-3 PCR products

圖3 牦牛Caspase-3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of secondary structure of yak Caspase-3 protein

圖4 牦牛Caspase-3 氨基酸序列生物功能預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of yak Caspase-3 amino acid biological function

2.4 Caspase-3 同源性對(duì)比及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

使用DNAMAN 將牦牛Caspase -3 與黃牛(XM_010820245.3)、山羊(NM_001286089.1)、綿羊(XM_015104560. 1)、野豬(NM _214131. 1)、馬(NM _001163961. 1)、人(NM _004346. 4)、小鼠(NM _001284409.1)、大 鼠(NM_012922. 2) 與 雞(NM_204725.1)進(jìn)行核苷酸及蛋白質(zhì)同源性分析(表2).結(jié)果顯示：克隆所得牦牛序列與黃牛核苷酸、氨基酸同源性最高，分別為99.52%、99.28%；其次是山羊和大鼠等核苷酸同源性為96.62 ～81.21%，蛋白質(zhì)同源性為94.55 ～83.27%；最后是牦牛與雞核苷酸、氨基酸同源性最低，分別為71.32%、70.16%.

表2 Caspase-3 核苷酸與氨基酸同源性分析Table 2 nucleotide and amino acid homology analysis of Caspase-3

使用Clustal X 與MEGA6 對(duì)牦牛Caspase -3 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖5)，發(fā)現(xiàn)牦牛與黃牛遺傳距離最近，與同源性比較結(jié)果一致. 可以看出，牦牛與黃牛首先聚為一小類(lèi)，再與山羊和綿羊聚為一類(lèi)，其次與野豬、馬、人、小鼠和大鼠聚為一類(lèi)，最后與雞聚為一類(lèi)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果與遺傳距離分析結(jié)果一致.

圖5 牦牛Caspase-3 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of yak Caspase-3

2.5 組織表達(dá)譜分析

利用熒光定量PCR 研究Caspase -3 在牦牛、黃牛各組織中mRNA 表達(dá)水平(圖6). 結(jié)果表明，Caspase-3 在牦牛與黃牛的下丘腦、垂體、卵巢、輸卵管和子宮組織中廣泛表達(dá)，但表達(dá)模式不同. 牦牛組織中，表達(dá)趨勢(shì)為輸卵管＞下丘腦＞子宮＞卵巢＞垂體，其中輸卵管的表達(dá)量顯著高于垂體表達(dá)量(P ＜0.05)；黃牛組織中，表達(dá)趨勢(shì)為子宮＞輸卵管＞卵巢＞垂體＞下丘腦，子宮表達(dá)量顯著高下丘腦表達(dá)量(P ＜0.05)；同時(shí)牦牛Caspase -3 組織表達(dá)量均高于黃牛相應(yīng)組織，其中下丘腦、輸卵管Caspase -3 表達(dá)量極顯著高于黃牛(P ＜0.01)，子宮Caspase -3 表達(dá)量顯著高于黃牛(P ＜0.05).

圖6 牦牛與黃牛Caspase-3 的組織相對(duì)表達(dá)Fig. 6 Relative expression ofCaspase-3 gene in yak and cattle

3 討論

眾所周知，細(xì)胞凋亡是基因控制的程序性死亡，Caspase-3 是哺乳類(lèi)細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者，處于蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵位置，也是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降解底物活性的最強(qiáng)蛋白水解酶，已成為細(xì)胞凋亡的早期生化指標(biāo)[17-18].

本試驗(yàn)成功克隆牦牛Caspase -3 基因CDS 序列，全長(zhǎng)834 bp，其中A=33.1%、T=26.9%、C =18.4%、G=21.6%，編碼277 個(gè)氨基酸，存在堿基偏好.與黃牛比發(fā)生兩個(gè)突變，第659 位C→T、678 位T→A，造成Ala→Val、Asn→Lys 氨基酸改變，第354 位C→T、399 位T→C 屬沉默突變. Xu 等使用Affymetrix-MegAllele Targeted 基因型檢測(cè)系統(tǒng)和分子倒置探針技術(shù)發(fā)現(xiàn)，中國(guó)女性Caspase-3 和Caspase-7 多態(tài)性可能在子宮內(nèi)膜癌易感性中發(fā)揮作用，Caspase 基因的遺傳多態(tài)性可能改變基因表達(dá)水平和功能從而影響機(jī)體繁殖能力[19]. 牦牛第659、678 位基因突變是否導(dǎo)致基因表達(dá)水平和蛋白質(zhì)功能改變，從而制約牦牛繁殖率，有待進(jìn)一步研究. 李軍對(duì)豬Caspase -3 基因克隆，擴(kuò)增得834 bp 開(kāi)放閱讀框，發(fā)現(xiàn)豬Caspase-3 基因編碼277 個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為32kDa，豬Caspase-3 基因與人和鼠的Caspase -3 序列同源性高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[20].蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牦牛Caspase-3 具蛋白水解切割位點(diǎn)，活性部位，底物結(jié)合位點(diǎn)和二聚體界面等，是典型CASc 家族成員[13-14].蛋白質(zhì)分析為酸性不穩(wěn)定親水蛋白，無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)，二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析得α -螺旋占據(jù)較大比重[20].

生物體本身存在清除活性氧的體系，例如：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、SOD 酶、抗壞血酸等，這一體系使生物體內(nèi)活性氧保持在對(duì)機(jī)體無(wú)害的水平.但牦牛生活的高輻射、高海拔、低含氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧[21]. 組織表達(dá)譜分析表明，Caspase-3 在牦牛和黃牛各組織中廣泛表達(dá)，其中牦牛輸卵管表達(dá)量顯著高于Caspase -3 基因在其余部位的表達(dá)(P ＜0.05).輸卵管是胚胎早期發(fā)育的重要器官，早期胚胎對(duì)氧化應(yīng)激損傷異常敏感[22].在小鼠胚胎早期培養(yǎng)中，2 -細(xì)胞期胚胎對(duì)活性氧最敏感，也最容易發(fā)生生長(zhǎng)阻滯[23].高濃度活性氧不僅影響2 -細(xì)胞期胚胎的基因調(diào)控，還引起胚胎氧化損傷，導(dǎo)致胚胎內(nèi)部穩(wěn)態(tài)失衡、胚胎發(fā)育能力下降及細(xì)胞質(zhì)破碎，使胚胎進(jìn)一步發(fā)生凋亡.同時(shí)，高活性氧處理組囊胚凋亡指數(shù)高于對(duì)照組， 囊胚率低于對(duì)照組[1-2，23-24].推測(cè)環(huán)境引起牦牛體內(nèi)活性氧增加，會(huì)造成組織氧化損傷及胚胎凋亡率上升，可能是輸卵管Caspase-3 表達(dá)量高的原因.在黃牛Caspase -3 組織表達(dá)譜中，子宮表達(dá)量顯著高于其余組織(P ＜0.05)，研究認(rèn)為子宮通過(guò)分泌多種有利激素來(lái)維持個(gè)體內(nèi)分泌平衡、防止內(nèi)分泌紊亂，是全身免疫中重要的一環(huán)，子宮細(xì)胞保持高凋亡率能有效預(yù)防腫瘤的形成[25].將子宮內(nèi)膜中Survivin 過(guò)表達(dá)、Caspase -3 表達(dá)下調(diào)，打破凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡，使子宮的凋亡功能減退，發(fā)現(xiàn)Survivin 與Caspase -3 的表達(dá)量可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生中起一定作用[26]. 大鼠經(jīng)2.45 GHz 電磁輻射后，卵巢上皮細(xì)胞Caspase-3 表達(dá)顯著增加(P ＜0.05)，卵巢組織總氧化劑狀態(tài)、氧化應(yīng)激指數(shù)水平增加、子宮組織充血. 提示電離輻射可能導(dǎo)致大鼠的卵巢、輸卵管和子宮組織的病理生理學(xué)或形態(tài)學(xué)變化[27].與未經(jīng)加壓的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞相比，加壓處理后的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞80%開(kāi)始表達(dá)Caspase-3，且在細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下觀察圓形及漂浮細(xì)胞較多，細(xì)胞體瘦小，大部分細(xì)胞崩解死亡[28].

推測(cè)，高海拔、高寒、強(qiáng)輻射的極端生存環(huán)境引起牦牛生殖軸中Caspase-3 高表達(dá)，造成生殖細(xì)胞凋亡率增加、組織發(fā)生病變，可能對(duì)牦牛繁殖性能產(chǎn)生不利影響.

4 結(jié)論

本研究成功克隆牦牛Caspase -3 基因CDS 區(qū)，編碼區(qū)全長(zhǎng)834 bp，編碼277 個(gè)氨基酸；Caspase -3在物種間較保守且符合動(dòng)物進(jìn)化進(jìn)程；組織表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)Caspase-3 在牦牛各組織中的表達(dá)量均高于黃牛且下丘腦、輸卵管Caspase-3 表達(dá)量極顯著高于黃牛(P ＜0.01)，子宮Caspase -3 表達(dá)量顯著高于黃牛(P ＜0.05)，推測(cè)Caspase-3 基因的高表達(dá)量與牦牛的低繁殖率這一特性有關(guān).