汪玉梅,胡金姍,吳愛芝,盧靜容,范倩,張譯心,榮莉,張翠仙
(廣州中醫(yī)藥大學中藥學院,廣東 廣州 510006)
重樓為百合科植物云南重樓Parispolyphyllasmith varyunnanensis(Franch.) Hand-Mazz或七葉一枝花Parispolyphyllasmith varchinese(Franch.) Hara的干燥根莖[1-2],是瀕危中藥材。由于重樓療效顯著,一直被醫(yī)家推崇。重樓性微寒,味苦,有小毒,具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效。目前,普遍認為重樓的藥效成分為重樓皂苷類成分[3-4]。市場上流通的含有重樓的中成藥產品有云南白藥、芪珍膠囊、肝復樂膠囊等,主要用于治療暑濕感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛無汗、腹痛吐瀉、水腫、小便不利[1]。由于市場對重樓需求旺盛、無序采挖等,導致重樓野生資源瀕臨枯竭狀態(tài),市場價格不斷攀升(目前為1.9元/g),重樓資源匱乏。針對以上問題,有學者提出從微生物角度進行資源保護[5]。目前,共有69個菌屬超過800種內生微生物被研究[6],但未見關于重樓皂苷或其直接相關次生代謝產物的研究報道。
GNPS(Global Natural Products Social Website)是新興的可視化分子網絡,對復雜體系的物質基礎給予“可視性”提示[7-9],廣泛應用于藥物發(fā)現(xiàn)、代謝、醫(yī)學等領域復雜體系的分子預測。GNPS的特點是可以通過天然物的二級質譜特征將天然物中具有相似二級質譜的成分聚集在一起,形成分子籠,且不同的母離子構建成形狀、尺寸和顏色意味著不同的化合物簇[10]。目前,GNPS已經收錄了22 644個化合物和235 850個譜圖[9],可以快捷、可視、簡便的用于指導天然物的分離,尤其是在結構新穎化合物的發(fā)現(xiàn)中具有明顯優(yōu)勢。如,黃璐琦等[11]采用分子網絡對傳統(tǒng)中藥天麻的化學成分進行研究,發(fā)現(xiàn)了152個化合物,其中70個化合物是新化合物;同時還對云南重樓和七葉一枝花的成分進行預測,共鑒定146個成分,新結構42個[12]。本研究旨在通過對重樓內生及根際土壤相關的微生物的研究,建立重樓微生物次生代謝產物的指紋圖譜和GNPS網絡,并對其化學成分進行初步預測,以期找到與宿主重樓相同或相近次生代謝產物的微生物,從而更有效地保護這一瀕危藥材,為重樓的資源保護提供新思路。
SW-CJ-1FD單人單面超凈工作臺(蘇州凈化設備廠);LX-B75L高壓滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療設備有限公司);HYG-A電熱恒溫搖床(太倉市試驗設備廠);AUY120電子分析天平(廣州湘儀機電設備有限公司);Sartorius賽多利斯十萬分之一天平(季爾國際貿易有限公司);XHRE-2000A旋轉蒸發(fā)儀(上海霄漢實業(yè)發(fā)展有限公司);SHZ-DⅢ真空水泵(河南鞏義予華儀器有限公司);XHDLSB-5/25低溫冷卻液循環(huán)泵(上海霄漢實業(yè)發(fā)展有限公司);AB SCIEX Triple TOFTM 5600+四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜(美國AB SCIEX公司)。
乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(分析純,廣州東巨精細化工有限公司);甲醇(GR,上海邁瑞爾科技有限公司);GF254型硅膠(青島海洋化工廠);AlCl3、H2SO4-EtOH、香草醛濃硫酸、KOH、FeCl3及KBiI4顯色劑(實驗室自制);TLC硅膠板(自制)。
重樓皂苷Ⅰ(C-036-151122,CAS:50773-41-6)、重樓皂苷Ⅱ(C-037-160623,CAS:76296-72-5)、重樓皂苷Ⅵ(C-038-160126,CAS:55916-51-3)和重樓皂苷Ⅶ(C-039-160623,CAS:76296-75-8)對照品均購買自成都瑞芬思生物科技有限公司。
處于營養(yǎng)生長期的健康重樓,于2017年12月31日采自貴州六盤水,經廣州中醫(yī)藥大學中藥學院彭光天博士鑒定為重樓屬百合科云南重樓正品(Parispolyphyllavar.yunnanensis,樣品編號為RP,保存在廣州中醫(yī)藥大學中藥學院中藥質量標準及天然藥物實驗室)。同期采集同根植株的根(樣品編號為RP-R)、根狀莖(樣品編號為RP-Rh)、莖(樣品編號為RP-S)、葉(樣品編號為RP-L)、根際土壤(樣品編號為RP-I),用無菌袋裝好后送至實驗室,低溫保存?zhèn)溆谩悠返玫胶? h內進行內生菌及根際土壤相關的微生物的分離。
微生物分離及發(fā)酵用培養(yǎng)基見表1和表2。
表1 微生物分離用培養(yǎng)基成分組成(1 L)Table 1 Composition of medium for the microorganisms isolation (1 L)
表2 微生物發(fā)酵用培養(yǎng)基成分組成(1 L)
Table2Composition of medium for the microorganisms fermentation (1 L)
培養(yǎng)基組成配方PDA葡萄糖(2.0%)、馬鈴薯(200.0 g)、蒸餾水1 000 mL。GPY葡萄糖(1.0%)、酵母膏(0.2%)、蛋白胨(0.1%),蒸餾水1 000 mL。真菌一號山梨醇(5.0%)、麥芽糖(4.0%)、味精(1.0%)、色氨酸(0.05%)、酵母膏(1.3%)、MgSO4·7H2O(0.03%)、KH2PO4(0.05%),蒸餾水1 000 mL。黃豆黃豆粉100.0 g,蒸餾水200.0 mL。大米大米100.0 g,蒸餾水200.0 mL。
將重樓葉、莖、芽、根、根狀莖按以下流程進行表面消毒:無菌水漂洗3次(1 min/次)→體積分數75%乙醇浸泡3 min→質量分數2.0%次氯酸鈉浸泡1 min→無菌水漂洗3次(1 min/次)[13-14]。最后一次漂洗所得的無菌水作為空白對照。消毒好的部位作為內生微生物分離備用。
取表皮消毒的重樓部位放入無菌研缽中研磨,吸取研磨液(原液)100 μL于EP管中,依次用無菌水分別稀釋10-1和10-3;分別取10-3和10-1稀釋液及原液進行平板涂布,每塊平板40 μL。取重樓根際土壤于EP管中溶于無菌水,用無菌水稀釋10-1和10-3,取10-3和10-1稀釋液進行平板涂布,每塊平板40 μL。不同重樓部位的不同濃度與土壤溶液的不同濃度分別在PDA、A1、CMM和M102培養(yǎng)基上各涂布2塊平板(無菌水1塊)。每種培養(yǎng)基各做1塊空氣空白平板,密封培養(yǎng)皿,貼好標簽后放入28.0 ℃培養(yǎng)箱重靜置培養(yǎng)。待以上固體培養(yǎng)基上長出菌落后,對比挑選生長狀態(tài)不同的菌落,用接種環(huán)將菌落挑起,于與原固體培養(yǎng)基相同的平板上劃線純化(“之”字形),使菌落逐步稀釋。整個過程在超凈工作臺上完成,密封培養(yǎng)皿,放入28.0 ℃培養(yǎng)箱重靜置培養(yǎng)。觀察菌落生長狀況。待平板上生長出單菌落之后,用接種環(huán)將菌落挑起,放入菌種保存管中(須高壓滅菌),加入40%甘油和原液體培養(yǎng)基體積比為1∶1約1 mL密封保存,-80 ℃冰箱保存菌株,保存菌種待用。
將菌種管從冰箱取出解凍后用接種環(huán)蘸取適量的菌液,接種到含有固體培養(yǎng)基的平板上,每種菌分別接種到瓊脂平板培養(yǎng)基上,置恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)3~5 d,待平板長出單菌落后,在顯微鏡下觀察,對比其生長狀態(tài)及形態(tài),挑選與保存前形態(tài)一致的菌落,采用微生物基因組測序方法(ITS及D1/D2)進行菌種鑒定[15-17]。
2.3.1 不同培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng) 根據菌種鑒定結果以及對菌株目前化學成分研究現(xiàn)狀的文獻總結,挑選其中具有典型特征的菌株:RP-I-2、RP-I-3、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3和RP-S-4,用接種環(huán)分別挑取目標菌株平板上長出的單菌落接種到裝有50 mL相應液體培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中,在28 ℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中(165 r/min)培養(yǎng)2~3 d,獲得目標菌株的種子培養(yǎng)液。吸取不同種子液(3.0 mL)分別加入不同的液體或固體培養(yǎng)基(1 L發(fā)酵瓶)進行發(fā)酵培養(yǎng),每種培養(yǎng)基分別發(fā)酵2.0 L。
真菌在28 ℃下靜置培養(yǎng)60 d;細菌于28 ℃搖床上(165 r/min)培養(yǎng)7 d;分別與空白培養(yǎng)基對比觀察是否有明顯的菌株生長,成長完畢加入甲醇(5 mL)停止發(fā)酵。
2.3.2 微生物次生代謝產物提取
2.3.2.1 細菌液體培養(yǎng)物 發(fā)酵完畢的細菌經離心得到菌體和菌液。菌液濃縮至200 mL,依次經等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取,有機相減壓濃縮得EtOAc-1相和n-BuOH-1相。菌體經甲醇重復浸泡(24 h/次、共3~5次),甲醇液減壓濃縮得甲醇提取物,水捏溶至200 mL,依次經等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取,有機相減壓濃縮得EtOAc-2相和n-BuOH-2相。4株細菌共得到10個EtOAc提取物和9個n-BuOH提取物(見表3),備用。
表3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)不同菌種得到的提取物的質量
Table3Weight of different extracts of 7 strains from different mediam/mg
培養(yǎng)基RP-I-4(真菌)ABRP-I-2(真菌)ABRP-I-3(真菌)ABRP-L-1ABRP-L-2ABRP-L-3ABRP-S-4ABPDAC598.5150.136.0191.21 312.21 797.051.9435.320.6181.4165.0383.172.9112.4D331.3888.1189.4295.01 337.1235.6769.882.8918.086.31 357.4220.9GPYC397.0339.6315.1385.8243.6250.624.4167.8D694.0460.9143.81 005.4484.0182.722.9249.8真菌一號C324.9408.7475.0753.7188.5144.0D979.0716.8702.1175.1769.2黃豆2 495.13 089.03 683.4350.5大米19 493.012 540.2897.2
注:A代表EtOAc; B代表n-BuOH; C代表菌(絲)體; D代表菌液。
2.3.2.2 真菌液體培養(yǎng)物 發(fā)酵完畢后經甲醇滅活后的發(fā)酵物經紗布過濾得到菌絲體和菌液。菌液濃縮至200 mL,依次經等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取,有機相減壓濃縮得EtOAc-1相和n-BuOH-1相;菌絲體經甲醇重復浸泡(24 h/次、共3~5次),甲醇液減壓濃縮得甲醇提取物,將提取物加水混懸至水溶液狀態(tài)(200 mL),依次經等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取,有機相減壓濃縮得EtOAc-2相和n-BuOH-2相。3株真菌共得到18個EtOAc提取物和18個正丁醇提取物(見表3),備用。
2.3.2.3 黃豆、大米培養(yǎng)基培養(yǎng)物 將發(fā)酵完畢后的固體培養(yǎng)基用乙酸乙酯[(500 mL/(瓶·次)]振搖提取3次,乙酸乙酯提取液減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏。共得到7個EtOAc提取物(見表3),備用。
2.4.1 供試品溶液的制備 將表3中得到的提取物分別精密稱取適量,置于1 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成終質量濃度為0.10 g/mL的供試品溶液,備用。
2.4.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ對照品適量,置于1 mL容量瓶中,加入甲醇溶解定容至刻度,配制成質量濃度為0.1 mg/mL的混合對照品溶液,備用。
2.4.3 TLC指紋圖譜的建立[13,18]分別用0.5 μL的點樣管吸取“2.4.1”項中的EtOAc相和n-BuOH相樣品,點于不同硅膠薄層板上,分別選取最優(yōu)展開體系PE-EtOAc(體積比2∶1)、PE-CH3OH(體積比9∶2)進行展開,取出,晾干。觀察條件分別為:EtOAc相,自然光、紫外燈(254 nm和365 nm)、H2SO4-EtOH(顯色后置自然光和紫外燈365 nm下檢視)、香草醛濃硫酸和KOH顯色劑;n-BuOH相,自然光、紫外燈(254 nm和365 nm)、H2SO4-EtOH(顯色后置自然光、紫外燈254 nm和365 nm下檢視)。
2.4.4 LC-MS指紋圖譜的建立[9,13,19]
2.4.4.1 樣品 取“2.4.1”項下正丁醇及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下樣品200 μL用于LC-MS測試用。
2.4.4.2 UPLC條件 流動相為ACN-H2O(0~5 min,10%~30%ACN;5~23 min,30%~90%ACN;23~28 min,100%ACN);流速為0.7 mL/min;進樣量為3 μL;柱溫為30 ℃;色譜柱為Phenomenex(5 mm,4.6 mm×100 mm)。將配制好的樣品于Triple TOF TM5600+質譜系統(tǒng)進行檢測。
2.4.4.3 MS條件 離子噴霧電壓:4 500 V;離子源溫度:550 ℃;碰撞能量:45 eV;擴散碰撞能量:15 eV;去簇電壓:100 V;霧化器壓力:379 kPa;輔助氣壓力:379 kPa;氣簾氣壓力:241 kPa;飛行時間質譜(TOF-MS)分子量掃描范圍:100~2 000。
2.4.5 GNPS分子網絡建設及數據處理 將“2.4.4”項下的正丁醇相及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下菌株次生代謝產物中選取28個樣品的二級質譜文件通過MSConvert軟件轉換后利用FileZilla FTP Client連接器導入GNPS分子網絡平臺(http://gnps.ucsd.edu),分別建立分子網絡圖譜,并與混合對照品和譜庫中的數據進行匹配;數據分析在Cytoscape軟件中進行。
本文從重樓中共分離得到32株微生物,結果見表4。
對菌株的菌(絲)體顏色、形狀等進行觀察,選擇其中比較有特色的14株進行菌種鑒定,結果顯示:RP-S-1和RP-S-6為假單胞菌屬(Pseudomonas,種未鑒定),RP-S-3、RP-L-2和RP-L-3均為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas,種未鑒定),RP-I-2、RP-I-3和RP-I-4均為籃狀菌屬(Talaromyces,種未鑒定),RP-S-2為紅酵母屬Rhodotorulasp.,RP-S-4為芽孢桿菌屬Bacillussp.,RP-S-5為細桿菌屬Microbacteriumsp.,RP-L-1為寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonassp.,RP-L-4為貪噬菌屬Variovoraxsp.,RP-I-1為Saitozymasp.。genbank提交序列號為:SUB5958782 RP-I-1,MN176340;SUB5958782 RP-I-2,MN176341;SUB5958782 RP-I-3,MN176342;SUB5958782 RP-I-4,MN176343;SUB5958782 RP-S-2,MN176344;SUB5958805 RP-L-1,MN177117;SUB5958805 RP-L-2,MN177118;SUB5958805 RP-L-3,MN177119;SUB5958805 RP-L-4,MN177120;SUB5958805 RP-S-1,MN177121;SUB5958805 RP-S-3,MN177122;SUB5958805 RP-S-4,MN177123;SUB5958805 RP-S-5,MN177124;SUB5958805 RP-S-6,MN177125。
3.3.1 不同菌株次生代謝產物的TLC指紋圖譜 在不同培養(yǎng)基、不同發(fā)酵時間對菌株RP-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4進行小規(guī)模發(fā)酵,得到各菌株的乙酸乙酯相TLC指紋圖譜見圖1,正丁醇相TLC指紋圖譜見圖2。從圖可見:重樓相關微生物的次生代謝產物顯色豐富;硫酸乙醇顯色效果較明顯,未顯色時365 nm下的藍綠色斑點顯色后為鮮綠色,日光下有黃色及紫色斑點,365 nm下為黃色及粉紅色,推測可能存在皂苷及酚酸類化合物;香草醛濃硫酸顯色效果亦較明顯,有藍紫色、藍綠色、黃色及黑色斑點,可能存在甾體及苯丙素類化合物;KOH顯色后,原來的橙紅色斑點變?yōu)樽仙?紫紅色,可能存在蒽醌類化合物。
表4 重樓不同部位的微生物種類及數量Table 4 Microbial species and quantities obtained from different parts of Paris polyphylla
365nm254nm自然光觀察365nm自然光乙酸乙酯顯色觀察香草醛濃硫酸顯色觀察現(xiàn)象現(xiàn)象KOH顯色現(xiàn)象
注:展開條件為PE-EtOAc(體積比2∶1),菌株次生代謝產物點樣順序為RP-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4 [RP-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1中點樣順序為PDA(菌絲體、菌液、空白)、GPY(菌絲體、菌液、空白)、真菌一號(菌絲體、菌液、空白)、大米(EtOAc,空白)、黃豆(EtOAc,空白,PE,空白);RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4點樣順序為PDA(菌絲體、菌液、空白)]。
圖1 7種菌株次生代謝產物的乙酸乙酯相TLC指紋圖譜Figure 1 TLC fingerprints of Ethyl acetate phase of secondary metabolites of 7 strains
注:展開條件為PE-CH3OH(體積比9∶2),菌株次生代謝產物點樣順序為RP-I-2、RP-I-4、RP-I-3、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4[RP-I-2、RP-I-4、RP-I-3中點樣順序為菌絲體(真菌一號、PDA、GPY)、RP-I-2菌液(真菌一號、PDA、GPY)、黃豆;RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4中點樣順序為菌絲體(PDA)、菌液(PDA)]。
圖27種菌株次生代謝產物的正丁醇相TLC指紋圖譜
Figure2TLC fingerprints ofN-butanol phase of secondary metabolites of 7 strains
3.3.2 重樓微生物次生代謝產物GNPS分析 GNPS分子網絡中相關的分子之間形成分子籠,這些化合物分子籠可能代表著同一類型化合物,而不同分子籠間的連接關系可能代表著2個類型化合物之間存在關聯(lián)。通過分子籠特征,分子網絡能夠快速找到與之關聯(lián)的相似物或者新化合物,為追蹤和預測某類成分提供有利指導[9-12]。以重樓活性物質為參照,通過二級質譜構建的不同菌株的GNPS分子網絡(見圖3~圖4),及實驗室已建立的重樓化學成分庫進行對比,發(fā)現(xiàn)并確定重樓微生物次生代謝產物與宿主有15個成分相同(見表5),結構類型涉及螺甾烷醇類、偏諾皂苷元類、苯丙素類、黃酮類、蒽醌類及甾體皂苷等化合物。其中,來源于重樓根際土壤的微生物次生代謝產物中所含此類成分最多,來源于重樓葉的內生菌中可能含有苷類、苯丙素類及黃酮類化合物,來源于重樓莖的內生菌中可能含有偏諾皂苷元,此結論與TLC分析可能含有皂苷類、甾體類、苯丙素類和蒽醌類化合物一致,推測重樓菌株發(fā)酵液中有與重樓主要化學成分相同的化學成分。同時,在對目標菌株的GNPS分子網絡分析中,RP-I-2菌及RP-I-4菌存在與宿主重樓相同的活性成分flazin(分子式為C17H12N2O4),這與前面的TLC以及LC-MS的分析結果一致,該菌值得后續(xù)重點研究。
CLZG-hunbiaoRP-L-1-GPY-B-n-BuOHRP-L-1-GPY-S-n-BuOHRP-L-1-GPDA-B-n-BuOHRP-L-1-PDA-S-n-BuOHRP-L-2-PDA-B-n-BuOHRP-L-2-PDA-S-n-BuOHRP-L-3-PDA-B-n-BuOHRP-L-3-PDA-S-n-BuOHRP-L-4-PDA-B-n-BuOHRP-L-4-PDA-S-n-BuOHCLZG-hunbiaoRP-1-2-been-n-BuOHRP-1-2-GPY-B-n-BuOHRP-1-2-GPY-S-n-BuOHRP-1-2-PDA-B-n-BuOHRP-1-2-PDA-S-n-BuOHRP-1-2-zhenl-B-n-BuOHRP-1-2-zhenl-B-n-BuOHRP-1-3-been-n-BuOHRP-1-3-GPY-S-n-BuOHRP-1-3-PDA-S-n-BuOHRP-1-3-zhenl-S-n-BuOHRP-1-4-been-n-BuOHRP-1-4-GPY-S-n-BuOHRP-1-4-PDA-B-n-BuOHRP-1-4-PDA-S-n-BuOHRP-1-4-zhenl-S-n-BuOH
圖37種菌株的GNPS網絡圖(Node中不同顏色代表不同培養(yǎng)基,節(jié)點之間連線代表2個化合物MS/MS圖譜之間的相關性)
Figure3GNPS network diagrams of 7 strains (different colors in Node represent different media,and connections between nodes represent the correlation between MS/MS profiles of two compounds)
1a1b3a3b2457a7b68a8b9b109a111213b1413a15
圖4重樓微生物次生代謝產物與宿主化學成分匹配分子籠放大圖
Figure4Molecular cage enlargement of the matching of microbial secondary metabolites and host chemical components inParispolyphylla
表5 GNPS分析重樓次生代謝產物與宿主匹配的化學成分信息Table 5 Chemical composition information for GNPS analysis of secondary metabolites matching host Paris polyphylla
從藥用植物內生菌次生代謝產物中尋找與宿主相同或相近的化學物質,以解決藥用植物資源稀缺的問題,是近年來的研究熱點。瀕危藥材重樓的主要藥用成分是甾體皂苷[3-4]。趙江林等[20]從華重樓(《中國藥典》收載的2種重樓基源植物之一)中分離得到2株細菌,并在TLC檢測中發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液與重樓總皂苷的層析帶遷移率相當,但由于TLC方法的局限性,在沒有其他分析手段的輔助下不能嚴格證實皂苷類成分的存在。本文從藥材重樓不同部位中共分離出20株內生菌,從其根際土壤中分離出12株根際相關的微生物,對其中的7株在不同培養(yǎng)條件下產生的次生代謝產物進行了TLC、LC-MS分析,并根據GNPS網絡分子籠的特點,通過與已知宿主重樓的化學成分進行LC-MS分析,得出15個與宿主相同或相似的化學成分,結構類型涉及螺甾烷醇類、偏諾皂苷元類、苯丙素類、黃酮類、蒽醌類及甾體皂苷等化學物質。其中,來源于重樓根際土壤的微生物次生代謝產物中所含此類成分最多,可能含有甾體及其苷類、生物堿類、蒽醌類、脂肪酸酯、苯丙素類、黃酮苷類化合物及寡糖,來源于重樓葉的內生菌中可能含有甾體及其苷類、苯丙素類及黃酮苷類化合物,來源于重樓莖的內生菌中可能含有偏諾皂苷元,這對進一步研究和開發(fā)重樓內生及根際相關的微生物次生代謝產物具有重要意義,同時也為重樓的資源保護提供參考依據。