甘椿椿1 金 湛1 汪琴猛2 陳 高1 金美花3

1.衢州職業(yè)技術學院醫(yī)學院，浙江 衢州 324000；2.浙江巨泰藥業(yè)有限公司，浙江 衢州 324000； 3.天津醫(yī)科大學，天津 300070

缺血性腦血管病為臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，約占腦血管疾病的85%，其病死率僅次于心臟病、腫瘤，是造成人類死亡的主要疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后大部分血管能自然再通或經(jīng)溶栓治療恢復再通，但同時也會造成進一步腦損傷和功能障礙，即腦缺血再灌注損傷[2]。許多研究證明，很多中藥中的有效成分對防治腦缺血損傷具有良好的療效，可通過調(diào)控腦缺血損傷的相關信號通路，減少炎癥級聯(lián)反應等方式減少腦缺血再灌注損傷。

海馬結構正常和功能完整是人類學習記憶的基礎，海馬神經(jīng)元損傷與腦卒中認知功能障礙的發(fā)病密切相關[3]。在腦缺血再灌注損傷中，海馬神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最易受累的腦區(qū)，對于缺血缺氧最為敏感，對缺血缺氧的耐受性差。取乳鼠海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)，既可重現(xiàn)其體內(nèi)生長過程，也易于使用各種技術檢測相關指標，能夠直觀反映藥物治療腦缺血再灌注損傷的效果，因此乳鼠海馬神經(jīng)元細胞是體外研究腦缺氧缺血再灌注損傷常用的模型[4]。

延胡索為罌粟科植物延胡索的干燥塊莖，具有活血、利氣、止痛的功效，臨床常用于胸脅、脘腹脹痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻和跌打腫痛等[5]。延胡索乙素作為延胡索的主要有效成分之一，在藥材以及制劑中常作為控制指標。已有研究證明延胡索乙素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心腦血管都有一定的預防和保護作用[6]。延胡索的中藥復方制劑有很多，例如玄歸止痛滴丸、玄胡索散等，均有活血止痛的作用，但是關于腦缺血的研究未見報到，筆者以體外乳鼠海馬神經(jīng)元細胞為研究對象，探討延胡索乙素對乳鼠海馬神經(jīng)元細胞因缺糖缺氧所致?lián)p傷的保護作用，為進一步開發(fā)延胡索及其復方制劑抗腦缺血研究提供一定的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 DMI4000B熒光倒置顯微鏡(德國徠卡公司)，LDZ5-2型低速自動平衡離心機(北京京立離心機有限公司)，Molecular Devices SpectraMAX Plus 384酶標儀(美國MD公司)。

1.2 藥品與試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)；BCA (bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒，超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 動物 SD乳鼠，雌雄兼用，1～3日齡，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供，許可證號SCXK(滬) 2008-0016(上海西普爾必凱實驗動物有限公司)。

2 方法

2.1 海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)[7]取新生24 h的乳鼠放進75%乙醇內(nèi)浸泡消毒，在無菌條件下分離出雙側海馬，充分剪碎，加入同體積0.25% 胰蛋白酶消化20 min，用含10% 胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，處理后放入37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24 h后全量換液(置換后的培養(yǎng)液由97% Neurobasal，2% B27，1% L-谷氨酰胺組成)，之后每3天半量換液。在海馬神經(jīng)元細胞接種3 d后加入終濃度為10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細胞生長。培養(yǎng)8 d后建立海馬神經(jīng)元缺氧缺糖細胞模型，并檢測相關指標。

2.2 實驗分組以及配藥 經(jīng)過CCK-8(Cell Counting Kit-8)法確定延胡索乙素濃度在0～100 μg/mL內(nèi)是非細胞毒劑量。取培養(yǎng)8 d生長成熟的海馬神經(jīng)元細胞，分為正常組、模型組、延胡索乙素低、中、高劑量組(2、4、8 μg/mL)、陽性對照藥尼莫地平組(8 μg/mL)。按照上述比例配置所需各濃度藥物，除正常組加入無糖DMEM/F12完全培養(yǎng)基外，其余各組均采用無糖Earle’s培養(yǎng)基與相應濃度的藥物配置。

2.3 乳鼠海馬神經(jīng)元細胞缺氧缺糖模型的建立 取培養(yǎng)8 d生長成熟的海馬神經(jīng)元細胞，按1×106個/mL的密度接種于6孔板，隨后將原培養(yǎng)液吸出，以PBS洗滌兩次，加入含有相應濃度藥物的無糖Earle’s培養(yǎng)基，除正常組外，其余各組均放置于缺氧裝置中，持續(xù)通入包含95%氮氣和5%二氧化碳的混合氣體，直至充滿裝置，封口膜密封，放入37 °C恒溫箱孵育4 h。4 h后取出，在倒置顯微鏡下觀察每組細胞形態(tài)。

2.4 生化指標的測定 按照“2.3”所述方法建立海馬神經(jīng)元細胞缺氧缺糖模型，隨后取各組細胞上清液，同時收集各組細胞并破碎，采用BCA法檢測蛋白含量。按照各試劑盒說明書，檢測細胞上清液中LDH含量以及各組細胞中SOD、GSH-PX、NOS活性和NO、MDA等生化指標含量。

2.5 細胞早期凋亡率的測定 將培養(yǎng)8 d生長成熟的海馬神經(jīng)元細胞，以0.25% 胰酶消化，制成細胞懸液，以3×105個/mL密度接種到12孔板，每孔終體積0.75 mL，分組情況同“2.2”項分組方法一致，每組設3個復孔，0.25% 胰酶消化收集各組細胞，PBS洗兩次，細胞密度調(diào)整為1×106個/mL。試管中加入100 μL細胞懸液。加入Annexin V-FITC/PI染料各5 μL后，輕輕混勻，室溫避光放置15 min，最后各試管中分別加入1×Binding-Buffer緩沖液。

3 結果

3.1 延胡索乙素對海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)學的影響 正常組的海馬神經(jīng)元呈錐形或多極性，胞體飽滿清晰、有明顯光暈，有強折光性及立體感；神經(jīng)元突起相互交織成網(wǎng)狀，細胞核明顯可見(圖1A)。模型組神經(jīng)元腫脹或變形，突起縮短并逐漸消失，胞質(zhì)內(nèi)顆粒變性明顯、光暈減弱，神經(jīng)元內(nèi)甚至出現(xiàn)了空泡物質(zhì)，神經(jīng)元損傷嚴重(圖1B)；延胡索乙素中、高劑量組(4、8 μg/mL)以及陽性藥尼莫地平組(8 μg/mL)海馬神經(jīng)元形態(tài)較完整，光暈減弱現(xiàn)象較輕，胞體內(nèi)空泡物質(zhì)減少(圖1D，E和F)。其中延胡索乙素中、高劑量組海馬神經(jīng)元形態(tài)明顯較好，說明延胡索乙素能夠明顯降低缺氧缺糖對海馬神經(jīng)元細胞的損害。如圖1所示。

3.2 延胡索乙素對相應生化指標的影響 與正常組相比，模型組的LDH的釋放量增加(P<0.01)，而SOD、NOS、GSH-PX的活性降低(P<0.01)，同時NO、MDA的含量明顯增加(P<0.01)。與模型組相比，延胡索乙素的中、高劑量組(4、8 μg/mL)能有效抑制LDH的釋放(P<0.01)，且SOD、NOS、GSH-PX的活性增加(P<0.01)，同時NO、MDA的含量顯著降低(P<0.01)，但是延胡索乙素的低劑量組的LDH的釋放量，SOD、NOS、GSH-PX的活性與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而NO、MDA的含量與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、表2。上述延胡索乙素中、高劑量組的生化指標的改變證明延胡索乙素能有效改善缺氧缺糖環(huán)境下腦組織的微環(huán)境。

組別給藥劑量NO/μmol/mgNOS/μmol/mgGSH-PX/U/mg正常組2.14±0.121.18±0.26182.70±6.38模型組5.81±0.231)6.05±0.581)62.33±4.481)延胡索乙素2 μg/mL5.44±0.272)5.82±0.2166.58±2.694 μg/mL4.15±0.133)4.68±0.253)103.65±6.353)8 μg/mL3.05±0.213)2.99±0.183)136.26±7.873)尼莫地平8 μg/mL4.60±0.193)3.28±0.263)121.36±5.383)

注: 與正常組比較，1)P<0. 01; 與模型組比較，2)P<0. 05，3)P<0. 01。

組別給藥劑量SOD/U/mgMDA/nmol/mgLDH/U/L正常組85.36±4.0116.23±2.5653.48±2.88模型組32.17±3.581)48.26±3.921)132.73±3.681)延胡索乙素2 μg/mL38.25±3.0236.62±2.583)126.31±5.854 μg/mL51.36±2.363)28.65±2.513)96.30±3.423)8 μg/mL66.52±2.983)22.47±3.523)74.58±3.853)尼莫地平8 μg/mL54.35±1.833)27.58±1.783)82.52±2.823)

注: 與正常組比較，1)P<0. 01; 與模型組比較，2)P<0. 05，3)P<0. 01。

3.3 延胡索乙素對海馬神經(jīng)元細胞早期細胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PC雙染色法檢測細胞凋亡，在此雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(FITC-/PI-)；右 下象限為早期凋亡細胞，顯現(xiàn)(FITC + /PI-)；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為(FITC + /PI-)，詳細結果如圖2所示。各組早期細胞凋亡的數(shù)據(jù)見表3，與模型組相比，延胡索乙素中、高劑量組能有效抑制細胞的早期凋亡(P<0. 01)，并存在一定的劑量依賴性。以上數(shù)據(jù)說明延胡索乙素中、高劑量組能夠顯著抑制缺氧缺糖損傷海馬神經(jīng)元的早期凋亡進程。

表3 延胡索乙素對細胞早期凋亡率的影響

注: 與正常組比較，1)P<0. 01; 與模型組比較，2)P<0. 05，3)P<0. 01。

4 討論

海馬神經(jīng)細胞體外生存能力較為脆弱，取材、種植、飼養(yǎng)、消化、凍存過程中需要注意以下關鍵環(huán)節(jié)：取材時為了保持組織的低基礎代謝率，海馬組織需放在冰浴的D-hanks液中。根據(jù)組織塊剪切的大小和量確定加胰蛋白酶的量、濃度、消化時間等，消化細胞時一定要在鏡下觀察消化情況防止消化過頭。阿糖胞苷需要選取專用于細胞培養(yǎng)級別的，而非用于臨床治療的[7]。

腦缺血發(fā)生后，多種因素以及多種損失機制共同影響機體的各項功能正常運轉，本研究證明了延胡索乙素能有效減輕由氧化應激以及細胞凋亡而導致腦缺血損傷。MDA是自由基對內(nèi)皮細胞損害后，引起生物膜上不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化反應的最終代謝產(chǎn)物，常用來反映組織脂質(zhì)過氧化損傷的程度[8]。而SOD作為目前發(fā)現(xiàn)的人體唯一的負氧離子天然酶類清除劑，其活性高低亦可間接反映組織自由基的含量[9]。LDH水平的增高是細胞受損的一個敏感指標，它能一定程度上反映細胞的損傷程度[10]。GSH-PX是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，能清除過氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[11]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，NO參與缺血性腦血管疾病的整個病理生理過程。在病理狀態(tài)下當NO產(chǎn)生過多時，它又是一種自由基，可造成膜脂質(zhì)過氧化并且反應生成毒性更大的超氧自由基,引起廣泛的脂質(zhì)過氧化及蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化反應,誘導DNA損傷。NO參與缺血性腦血管疾病表現(xiàn)為雙重作用，這主要催化NO生物合成的酶NOS所決定的。NOS以L2精氨酸(LZArg)和分子氧為底物，催化兩個等價的肌基氮之一，經(jīng)氧化反應生成NO和LZ肌氨酸。NOS是NO合成過程中的重要限速因素，體內(nèi)NO的生物作用完全依賴于NOS的活性[12]。

細胞凋亡是指機體受到損傷時，為維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細胞在基因調(diào)控下的主動程序性死亡。Annexin V-FITC/PC雙染色法檢測以此現(xiàn)象為基礎，對早期凋亡的細胞進行檢測，從而通過細胞凋亡率反映出腦缺血損失的程度。

實驗結果表明延胡索乙素使造模后細胞內(nèi)SOD活性增加，MDA水平下降，LDH釋放量減少，該結果表明延胡索乙素對海馬神經(jīng)元的保護作用可能與抗氧化損傷作用有關，一定程度上顯現(xiàn)了對氧化損傷的保護作用；延胡索乙素可以使缺氧缺糖時細胞內(nèi)GSH-PX水平下降，起到保護細胞的作用；一定程度上能降低缺氧缺糖時NO、NOS的水平。綜上所述，延胡索乙素對腦缺血損失有非常顯著的保護作用，它可以保護細胞膜的完整性，減少損傷時細胞膜的通透性，增強機體抗氧自由基的能力，減少脂質(zhì)過氧終產(chǎn)物的生成，減輕細胞早期凋亡，有效對抗腦缺血損失，延胡索乙素在腦缺血疾病的治療中有著非常寬廣的應用領域。