陳 磊， 唐成林， 熊 萬， 王禮科， 羅夫來， 趙 致

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省藥用植物繁育與種植重點(工程)實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州省農(nóng)業(yè)展覽館， 貴州 貴陽 550001)

白及〔Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.〕別名連及草，為蘭科多年生草本藥用植物[1]。喜潮濕，陰生環(huán)境下生長。原產(chǎn)于長江流域，主產(chǎn)于貴州、江西、四川、湖南等地[2]。白及以塊莖入藥，含有白及膠多糖、多酚類、菲類等物質(zhì)，性苦，具有消腫生肌、收斂止血、消炎抗菌的藥理作用[3-6]。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥材備受青睞，在貴州大規(guī)模栽培中藥材，但很多地方培育的種苗質(zhì)量參差不齊。隨著市場需求的變化，對藥材種苗質(zhì)量要求越來越高。因此，對白及組培瓶苗的質(zhì)量進(jìn)行等級劃分對貴州產(chǎn)白及組培瓶苗質(zhì)量的分級、市場的銷售和栽培有著重要意義。近年來，對白及的研究主要集中在組織要培養(yǎng)[7-9]、種質(zhì)資源[10-11]和藥理作用等方面[12-13]。白及種苗質(zhì)量方面的研究相對較少，僅有張智慧[14]對云南產(chǎn)白及組培苗質(zhì)量分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初步研究。目前，針對貴州產(chǎn)白及組培瓶苗質(zhì)量等級的劃分和組培瓶苗質(zhì)量與存活率關(guān)系的研究未見報道。為此，筆者以白及組培瓶苗為試驗材料，對組培瓶苗農(nóng)藝性狀進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和K-均值聚類分析，制定出貴州產(chǎn)白及組培瓶苗質(zhì)量分級初級標(biāo)準(zhǔn)，通過組培瓶苗存活率、植株長勢等確定等級劃分的科學(xué)性與合理性，以期為貴州產(chǎn)白及組培瓶苗的質(zhì)量分級、銷售、煉苗移栽提供參考和借鑒。

1材料與方法

1.1試驗材料

白及種子：由大方縣德馨堂中醫(yī)院提供。通過組培方法將白及種子培育成幼苗，再轉(zhuǎn)接到假鱗莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)100 d左右獲得具有根、莖、葉的完整白及組培瓶苗；栽培基質(zhì)為椰子殼、蛭石和有機(jī)質(zhì)，能很好的保持土壤的透氣性和排水效果，同時能為白及苗的生長提供所必須的營養(yǎng)元素。

1.2試驗方法

1.2.1白及組培瓶苗的分級將白及組培瓶苗從培養(yǎng)瓶中取出，隨機(jī)選擇完整的植株300株，對待分級組培瓶苗數(shù)量(300株)進(jìn)行巴特利特球形檢驗，確定選擇的樣本數(shù)是否滿足質(zhì)量分級的要求。測量植株假鱗莖直徑(X1)、株高(X2)、葉片數(shù)(X3)、葉寬(X4)、葉長(X5)、莖粗(X6)、根數(shù)(X7)等農(nóng)藝形狀，將所測得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析以及K-均值聚類分析，對白及組培瓶苗質(zhì)量等級進(jìn)行初步劃分，分級作為白及組培瓶苗的初級分級標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2白及組培瓶苗分級標(biāo)準(zhǔn)的驗證按照等級將白及組培瓶苗移栽至已配好的基質(zhì)上，進(jìn)行盆栽試驗，每盆5株，每個等級20盆，培養(yǎng)90 d， 比較不同等級白及組培苗的存活率、相對葉綠素含量(使用SPAD儀器進(jìn)行測定)的變化，各等級白及植株假鱗莖、株高、葉長和葉寬的平均生長量以及出芽率和單株苗的新芽數(shù)的差異，考察不同等級白及組培瓶苗等級劃分的合理性。

存活率=(存活的苗數(shù)÷總苗數(shù))×100%。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Office Excel2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，利用SPSS23.0對白及組培苗的假鱗莖直徑、株高等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析、K-均值聚類分析和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1白及組培瓶苗等級的劃分

2.1.1白及農(nóng)藝性狀指標(biāo)分布頻率由圖1可知，除根數(shù)以外，假鱗莖直徑、株高、葉片數(shù)、葉寬、葉長和莖粗基本滿足正態(tài)分布，分別集中分布在2.5～7.5 mm、2～8.75 cm、3～4片、4～10 mm、0.75～6 cm和1.43～3.43 mm范圍。

圖1白及各農(nóng)藝性狀指標(biāo)頻率分布

Fig.1 Frequency distribution of various agronomic traits indicators ofBletilla

2.1.2白及組培瓶苗樣本數(shù)有效性檢驗經(jīng)巴特利特球形檢驗，取樣足夠度的 Kaiser-Meyer-Olkin度量檢驗系數(shù)(KMO)為0.642>0.5，顯著性Sig(P)=0<0.05，說明樣本數(shù)結(jié)構(gòu)效度合格，可以進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和K-值聚類分析。

2.1.3白及組培瓶苗農(nóng)藝性狀的相關(guān)性從表1可知，白及假鱗莖直徑與株高、葉寬、葉長及根數(shù)存在極顯著正相關(guān)，與莖粗存在顯著正相關(guān)，與葉片數(shù)存在相關(guān)性但并不顯著；株高與葉片數(shù)、葉寬、葉長、莖粗、根數(shù)均存在極顯著正相關(guān)；葉片數(shù)與葉寬、葉長、莖粗存在極顯著正相關(guān)，與根數(shù)存在相關(guān)性但不顯著；葉寬與葉長、莖粗、根數(shù)均存在極顯著正相關(guān)；葉長與莖粗、根數(shù)存在極顯著正相關(guān)；莖粗與根數(shù)存在極顯著正相關(guān)。其中，株高和葉長的相關(guān)系數(shù)最高，達(dá)0.944。

表1 白及組培瓶苗各農(nóng)藝性狀間的相關(guān)系數(shù)

注：*、**分別表示在0.05和0.01水平相關(guān)性顯著和極顯著。

Note：*and** indicate significant correlations at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

2.1.4白及組培瓶苗農(nóng)藝性狀主成分分析主成分分析是將不存在直接相關(guān)性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，從而達(dá)到綜合評價性狀目標(biāo)的方法[15]。試驗從7個特征合計值中，選取了特征合計值較大的3個主成分(表2)。第I主成分的貢獻(xiàn)率為39.832%，第II個主成分的貢獻(xiàn)率為17.153%，第III主成分的貢獻(xiàn)率為15.125%，3個主成分的累計貢獻(xiàn)率為72.11%，能有效反應(yīng)數(shù)據(jù)的變化趨勢，同時也說明前三個主成分包含了白及組培瓶苗農(nóng)藝性狀大量的指標(biāo)信息含量，符合主成分分析的要求。

從表3可知，第I主成分與株高、葉長呈較大的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.855和0.837。因此第I主成分主要反映株高的生長性狀，可以稱為株高生長因子。第II主成分與葉片數(shù)、葉寬、莖粗、根數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.591、0.229、0.664和0.234；與假鱗莖直徑、株高和葉長呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.223、-0.4和-0.417，因此第II主成分主要反映的是植株葉片和莖的生長情況。第III主成分與假鱗莖直徑和根數(shù)呈較大的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.423和0.168，第III主成分主要反映白及莖下部生長情況，因此可以稱為假鱗莖生長發(fā)育和根部生長因子。

表2白及組培瓶苗農(nóng)藝性狀3個主成分的特征合計值與貢獻(xiàn)率

Table 2 Eigen values of three principal components and their contributions of the agronomic traits ofBletillatissue culture seedlings

主成分Principal component特征合計Eigen value方差貢獻(xiàn)率/%Contribution累計方差貢獻(xiàn)率/%Cumulative contributionI2.78839.83239.832II1.20117.15356.985III1.05915.12572.110

第一主成分的表達(dá)式為Y1=0.326X1+0.512X2+0.236X3+0.396X4+0.501X5+0.325X6+0.246X7，表明，第一主成分主要由變量X2(株高)、X5(葉長)和X1(假鱗莖直徑)所決定。第二主成分表達(dá)式為Y2=-0.203X1-0.365X2+0.474X3+0.209X4-0.381X5+0.606X6+0.214X7，其主成分主要是由變量X3(葉片數(shù))和X6(莖粗)決定；第三主成分表達(dá)式為Y3=0.441X1-0.207X2-0.551X3+0.163X4-0.248X5-0.032X6+0.661X7，其主成分主要是由變量X1(假鱗莖直徑)和X7(根數(shù))決定。綜合三個主成分的表達(dá)式，參考相關(guān)性分析結(jié)果、3個主成分的方差貢獻(xiàn)率和各成分指標(biāo)得分，參照假鱗莖與株高是評價白及質(zhì)量的主要考慮指標(biāo)的研究結(jié)論[14]，最終將假鱗莖直徑、株高2個主要指標(biāo)作為貴州產(chǎn)白及組培瓶苗質(zhì)量分級的主要考慮指標(biāo)。

表3白及組培瓶苗主成分與農(nóng)藝性狀因子的相關(guān)系數(shù)

2.1.5白及組培瓶苗質(zhì)量等級的初步劃分由表4可知白及組培瓶苗假鱗莖最終的3個聚類中心值分別為5.06 mm、4.54 mm和6.67 mm；株高的聚類中心值分別為4.59 cm、4.29 cm和7.66 cm。將聚類中心值作為白及組培瓶苗質(zhì)量等級劃分的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合實際生產(chǎn)，白及組培瓶苗質(zhì)量劃分為3個等級， I級苗為假鱗莖直徑≥7 mm，株高≥8 cm；II級苗假鱗莖直徑≥5.5 mm，株高≥4 cm；III級苗假鱗莖直徑≥4 mm，株高≥4 cm(表5)。

表4白及組培瓶苗2個等級劃分指標(biāo)的聚類中心

Table 4 Cluster center of two grades ofBletillatissue culture seedlings

農(nóng)藝性狀 Agronomic traitsⅠⅡⅢ假鱗莖直徑/mm Bulb diameter5.064.546.67株高/cm Plant height4.594.297.66

表5白及組培瓶苗的分級標(biāo)準(zhǔn)

Table 5 Grading standards ofBletillatissue culture seedlings

農(nóng)藝性狀 Agronomic traitsⅠ級Ⅱ級Ⅲ級假鱗莖直徑/mm Bulb diameter≥7≥5.5≥4株高/cm Plant height≥8≥4≥4

2.2白及組培瓶苗等級劃分合理性的驗證

2.2.1不同等級白及組培瓶苗煉苗情況及存活率煉苗后， I級苗的植株健壯，葉片寬厚肥大、深綠色，假鱗莖能很快由綠色變?yōu)榘咨劳雎实?，長勢良好，有新葉片、新芽長出，植株高，其存活率為91.67%；II級苗植株健壯，葉片深綠色，長勢良好，有新葉長出，植株較高，其存活率為68.33%；III級苗的植株較為健壯，葉綠色，長勢緩慢，植株較高，其存活率為56.67%；等外苗的植株弱小，葉片小、淺綠色，不易適應(yīng)外界條件，存活率低，為34.54%。

2.2.2不同等級白及組培瓶苗移栽后葉綠素變化情況從圖2可知，不同等級白及組培瓶苗移栽后，緩苗期相對葉綠素含量下降，緩苗期后，葉綠素含量開始上升，最后達(dá)到相對穩(wěn)定狀態(tài)。但在各個等級之間相對葉綠素含量差異不明顯。

圖2不同等級組培瓶苗的葉綠素變化

Fig.2 Chlorophyll at different grades ofBletillatissue culture seedlings

2.2.3煉苗后白及組培瓶苗質(zhì)量的比較從表6可知，培養(yǎng)90 d后，假鱗莖直徑表現(xiàn)為III級苗>I級苗>II級苗，I級苗和II級苗假鱗莖直徑平均增長量小于III級苗，這是因為I級苗和II級苗煉苗時的基礎(chǔ)值較大。隨著培養(yǎng)時間延長，I級苗植株葉片出現(xiàn)死亡，即“倒苗”現(xiàn)象，導(dǎo)致I級苗株高、葉長都小于II級苗和III級苗；葉寬略大于III級苗，小于II級苗。白及植株倒苗后，主要是體現(xiàn)在新芽的產(chǎn)生和根數(shù)的增加，I級苗出芽率達(dá)70%，新芽數(shù)在1～2個/株，且多數(shù)假鱗莖已經(jīng)分叉成“弓”形；II級苗假鱗莖直徑平均增長量相對較小，但株高、葉長、葉寬的平均生長量略大于I級苗和III級苗，“倒苗”數(shù)較少，出芽率約50%，且新芽數(shù)多為1個/株，根數(shù)基本無明顯變化；III級苗假鱗莖直徑平均增長量略大于I級苗和II級苗，主要是因為假鱗莖直徑的基礎(chǔ)值都相對集中，煉苗期間生長狀況良好，幾乎無“倒苗”現(xiàn)象，植株地上部分健壯，有利于白及苗地下假鱗莖的生長，但是出芽率遠(yuǎn)低于I級苗和II級苗，僅為10%，新芽數(shù)均為1個/株。

表6 不同等級白及組培瓶苗煉苗后的農(nóng)藝性狀

3結(jié)論與討論

對白及組培瓶苗的質(zhì)量分級不僅要具有一定的科學(xué)性與合理性，還要與生產(chǎn)實踐和實際應(yīng)用相結(jié)合。白及組培瓶苗主成分分析結(jié)果表明，白及組培瓶苗的質(zhì)量分級主要指標(biāo)為假鱗莖直徑、株高、葉片數(shù)。有研究指出[16]，白及假鱗莖的質(zhì)量是決定白及苗存活的關(guān)鍵因素，假鱗莖直徑越大，其存活率越高，株高和葉片數(shù)是體現(xiàn)白及苗健壯程度。通過對組培瓶苗進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和K-聚類分析，確定了白及組培瓶苗質(zhì)量分級指標(biāo)為假鱗莖直徑和株高，并將組培瓶苗分為3個等級，I級苗為假鱗莖直徑≥7 mm，株高≥8 cm；II級苗假鱗莖直徑≥5.5 mm，株高≥4 cm；III級苗假鱗莖直徑≥4 mm，株高≥4 cm。白及組培瓶苗質(zhì)量越好，移栽后其植株存活率越高，即I級苗存活率(91.67%)>II級苗(68.33%)>III級苗存活率(56.67%)>等外苗存活率(34.54%)；I級苗假鱗直莖總體平均增長值大于II級苗，微小于III級苗，但對于個別植株而言，其增長量遠(yuǎn)大于II級和III級苗，出芽率和新芽數(shù)也相對較高，出芽率為70%，新芽數(shù)一般為1～2個/株；每個等級的組培瓶苗在移栽后其相對葉綠素都有下降的趨勢，度過緩苗期，相對葉綠素含量開始上升，到一定的程度后趨于穩(wěn)定，但各等級苗之間的相對葉綠素差異不明顯。