潘勝東, 童廷德, 葉美君, 陳曉紅, 金米聰

(1.寧波市疾病預(yù)防控制中心, 浙江省微量有毒化學(xué)物健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315010; 2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司, 上海 201206; 3.中華全國供銷總社杭州茶葉研究院, 浙江 杭州 310016)

草甘膦(glyphosate, GLY)是一種高效廣譜滅生性除草劑,廣泛用于茶園、果園和麥田等,其生產(chǎn)量與市場銷售額一直高居除草劑之首,約占全球除草劑市場份額的30%[1]。GLY及其代謝物氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid, AMPA)能引起乙酰膽堿酶的活性降低[2]以及人體紅細(xì)胞活性氧的增加[3]。此外,有研究表明GLY能引起實(shí)驗(yàn)大鼠的肝損傷[4]以及干擾牛的卵巢正常機(jī)能[5]。2017年GLY被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)列入2A類致癌物[1]。近年來,美國孟山都開發(fā)了抗GLY轉(zhuǎn)基因小麥并得到了美國監(jiān)管部門的批準(zhǔn),該小麥植株可以耐受高濃度的GLY,為面粉中GLY殘留埋下了安全隱患。2018年8月,美國環(huán)境工作組(EWG)對(duì)多個(gè)品牌的45份燕麥產(chǎn)品抽檢,結(jié)果全部檢出GLY殘留,其中不乏許多知名品牌,一時(shí)間引起社會(huì)的廣泛關(guān)注與憂慮。迄今,包括中國和歐盟(EU)在內(nèi)的許多國家及國際組織對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中GLY的最大殘留量(MRL)有著嚴(yán)格的限量規(guī)定,如GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)小麥粉、全麥粉和小麥中GLY的MRL規(guī)定分別為0.5、5和5 mg/kg;歐盟(EU)對(duì)小麥、燕麥和蕎麥中GLY的MRL規(guī)定分別為10、20和0.1 mg/kg[6],但我國未對(duì)燕麥中GLY的MRL加以規(guī)定。

目前,GLY及其代謝物AMPA的檢測方法主要包括離子色譜(IC)法[7]、液相色譜-熒光(LC-FL)法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[9]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[10-17]等。其中IC法抗干擾能力差,需要對(duì)樣品提取液中大量雜質(zhì)離子與目標(biāo)分析物進(jìn)行有效分離才能達(dá)到準(zhǔn)確定量,具有成本高和實(shí)用性差等缺陷。LC-FL法測定GLY和AMPA需要配備柱后衍生裝置,且用到巰基乙醇或巰基乙胺等氣味較大的化學(xué)試劑,具有靈敏度差和假陽性率高等不足。GB/T 23750-2009采用GC-MS法測定植物性產(chǎn)品中GLY的殘留量,該方法使用易揮發(fā)的衍生化試劑三氟乙酸酐,衍生化條件苛刻,不利于實(shí)驗(yàn)室的日常檢測。隨著LC-MS儀的普及,LC-MS法已被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境樣品和生物樣品中GLY和AMPA的檢測。由于GLY和AMPA的相對(duì)分子質(zhì)量小、極性強(qiáng),在常規(guī)的反相色譜柱上保留時(shí)間很短,因此目前大部分文獻(xiàn)及SN/T 1923-2007《進(jìn)出口食品中草甘膦殘留量的檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》報(bào)道的LC-MS方法均采用9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC-Cl)進(jìn)行柱前衍生反應(yīng)后再進(jìn)行檢測[11-13]。衍生化方法雖然能提高檢測靈敏度和色譜保留,但衍生化操作過程較為繁瑣,方法重現(xiàn)性差,在實(shí)際檢測工作中應(yīng)盡可能避免。SN/T1923-2007方法采用美國Bio-Rad CAX陽離子交換濕柱需要保證小柱不干涸,柱體積大、吸附容量小,且需采用常壓過柱方式,洗脫液體積大,且含水量高,進(jìn)一步濃縮耗時(shí)長,不利于實(shí)際工作的開展。雖有文獻(xiàn)[13,14]報(bào)道基于LC-MS的非衍生化法直接測定GLY和AMPA,但多集中于基質(zhì)簡單的水樣,局限性大,針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的食品樣品的報(bào)道相對(duì)較少。SN/T 4655-2016《出口食品中草甘膦及其代謝物殘留量測定方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》采用LC-MS/MS非衍生化直接測定茶葉、玉米和稻谷等出口食品中GLY和AMPA,該法采用透析袋超聲、RP(reversed-phase)柱和GCB(grafted carbon black)粉末進(jìn)行3步凈化過程,操作較為繁瑣,且GCB屬于非特異性吸附劑,對(duì)GLY和AMPA可能會(huì)有一定的吸附性,從而導(dǎo)致目標(biāo)物的損失。江燕等[16]采用親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法直接測定稻米中的GLY和AMPA殘留量,使用水提取后,用C18小柱和超濾膜凈化,取流出液進(jìn)行檢測,該方法使用C18柱凈化雖然能夠除去疏水性干擾物,但難以除去提取液中離子型干擾物,不僅可能影響測定結(jié)果,還可能縮短氨基化色譜柱的壽命。周爽等[17]比較了MAX小柱、氨基柱和HLB小柱固相萃取小柱對(duì)植物性食品提取液凈化性能的影響,結(jié)果表明,使用MAX小柱得到最優(yōu)的結(jié)果,但該方法采用乙酸銨-乙腈的弱酸性流動(dòng)相體系進(jìn)行分離檢測,峰形拖尾嚴(yán)重。

隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的日趨成熟,精確分子量定性與定量所體現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)為食品中有毒有害污染物的快速測定提供了有效的解決方案。本文采用混合陽離子交換固相萃取(MCX)凈化,以氨基化高分子基HILIC柱為色譜分離柱,建立了基于超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(UPLC-HRMS)的非衍生化測定面粉與燕麥中GLY和AMPA殘留的分析方法,可滿足實(shí)驗(yàn)室日常監(jiān)測的需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters UPLC I Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司); Q-Exactive Orbitrap型高分辨質(zhì)譜儀和Trace finder 3.3數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司); Legend RT型離心機(jī)(德國Heraeus公司); Sigma 1-14K高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);固相萃取裝置(美國Agilent公司)。

LC-MS級(jí)乙腈和甲醇購自美國Thermo Fisher公司;HPLC級(jí)氨水購自德國Sigma公司;有證標(biāo)準(zhǔn)品草甘膦(GLY,純度>98%)和氨甲基膦酸(AMPA,純度>98%)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;有證內(nèi)標(biāo)物1,2-13C215N-GLY(100 mg/L)和13C15N-AMPA (100 mg/L)購自北京振翔科技有限公司。Oasis?MCX固相萃取小柱(150 mg/6 mL)、Oasis?PRiME HLB固相萃取小柱(150 mg/6 mL)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)購自美國Waters公司;ProElut GLY專用柱(6 mL)和Dikma Polyamino HILIC色譜柱(150 mm×2.0 mm, 5 μm)購自迪馬科技。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理

將采集的燕麥采用攪拌機(jī)粉碎,過80目篩,面粉直接過80目篩,置于50 mL塑料離心管中,于-20 ℃保存,待測。

分別稱取經(jīng)粉碎與過篩的小麥粉和燕麥粉2.0 g(精確至0.01 g),置于50 mL離心管中,加入100 μL 10.0 mg/L 1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入10 mL,水渦旋提取10 min,然后超聲提取10 min,以8 500 r/min的速度離心5 min。取5 mL上清液,過經(jīng)5 mL甲醇和5 mL水活化與平衡的MCX固相萃取小柱凈化,棄去前3 mL流出液,收集后2 mL流出液。準(zhǔn)確移取0.5 mL上述溶液于1.5 mL離心管中,加入0.5 mL乙腈,渦旋5 s,以16 000 r/min的速度離心5 min,過0.22 μm有機(jī)相濾膜,待測。

1.2.2色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為Dikma Polyamino HILIC色譜柱(150 mm×2.0 mm, 5 μm);流動(dòng)相A相為5 mmol/L pH 10.5乙酸銨溶液,B相為乙腈。梯度洗脫程序:0～2.00 min, 80%B; 2.00～3.00 min, 80%～10%B; 3.00～7.00 min, 10%B; 7.00～7.01 min, 10%～80%B; 7.01～10.00 min, 80%B;流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:負(fù)離子掃描;離子源溫度:320 ℃;定量檢測方式:平行反應(yīng)監(jiān)測模式(PRM);電噴霧電壓:-3 000 V;脫溶劑化氣壓力:275.8 kPa;輔助氣速率:180 L/h;射頻棱鏡電壓(S-lens RF level): 60%;輔助氣加熱溫度:300 ℃;分辨率:17 500;自動(dòng)增益控制(AGC): 2×104;最大注入時(shí)間(Max IT); 150 ms;質(zhì)荷比隔離窗口(isolation window): 1.0m/z。其他質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 GLY及其代謝產(chǎn)物AMPA的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion pair.

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1 g/L GLY和AMPA的單標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg GLY和AMPA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用超純水溶解、定容至10.0 mL。

10 mg/L GLY和AMPA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確吸取1.0 g/L GLY和AMPA的單標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL,用超純水稀釋至10 mL。

1.0 mg/L GLY和AMPA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別準(zhǔn)確吸取10 mg/L GLY和AMPA的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL,用超純水稀釋至10 mL。

10 mg/L 1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA混合內(nèi)標(biāo)溶液:分別準(zhǔn)確吸取0.5 mL 100 mg/L 1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA內(nèi)標(biāo)溶液,用超純水稀釋、定容至5.0 mL。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確吸取1.0 mg/L GLY和AMPA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50.0、100、250、500、1 000 μL于10.0 mL容量瓶中,加入5.0 μL 10 mg/L 1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA,然后用超純水稀釋定容至刻度,配制成5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為25.0 μg/L。

1.2.4基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

分別準(zhǔn)確稱取6份2.00 g(精確至0.01 g)空白面粉和燕麥樣品于50 mL離心管中,加入10 mL水渦旋提取10 min,然后超聲提取10 min,以8 500 r/min的速度離心5 min。取5 mL上清液經(jīng)MCX小柱凈化,收集2 mL流出液,加入2 mL乙腈,渦旋5 s,以16 000 r/min的速度離心5 min,過0.22 μm有機(jī)相濾膜,收集樣品溶液。采用凈化后的樣品溶液作為溶劑配制5.0、50.0和100.0 μg/L GLY和AMPA,同時(shí)加入兩種內(nèi)標(biāo)溶液,使其終質(zhì)量濃度為25.0 μg/L。取另5 mL未經(jīng)凈化的樣品提取液,加入5 mL乙腈,渦旋5 s,以16 000 r/min的速度離心5 min,過0.22 μm有機(jī)相濾膜,收集樣品溶液,采用未凈化的樣品溶液作為溶劑配制5.0、50.0和100.0 μg/L GLY和AMPA,同時(shí)加入兩種內(nèi)標(biāo)溶液,使其終質(zhì)量濃度為25.0 μg/L。采用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈-水溶液作為溶劑,配制5.0、50.0和100.0 μg/L GLY和AMPA。通過UPLC-HRMS測定GLY和AMPA及其內(nèi)標(biāo)物的峰面積。分別作基質(zhì)匹配和溶劑外標(biāo)曲線和內(nèi)標(biāo)曲線。基質(zhì)效應(yīng)以η表示:η=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。其中,外標(biāo)法基質(zhì)效應(yīng)ηex=(基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線斜率-溶劑外標(biāo)曲線斜率)/溶劑外標(biāo)曲線斜率[18,19],內(nèi)標(biāo)法基質(zhì)效應(yīng)ηis=(基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)曲線斜率-溶劑內(nèi)標(biāo)曲線斜率)/溶劑內(nèi)標(biāo)曲線斜率。|η|值越大,說明基質(zhì)效應(yīng)越大,且η值正負(fù)分別代表基質(zhì)增強(qiáng)和基質(zhì)抑制作用。

1.2.5方法準(zhǔn)確度與精密度實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取18份2.00 g(精確至0.01 g)空白面粉和燕麥粉樣品于50 mL離心管中,加入100.0 μL 10.0 mg/L 1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA內(nèi)標(biāo)混合溶液。分別準(zhǔn)確加入10.0 mg/L GLY和AMPA的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各20、100和400 μL,配制成低、中、高3個(gè)水平(0.1、0.5和2.0 mg/kg)的加標(biāo)樣品,每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行試驗(yàn)。分別加入10 mL水,渦旋提取10 min,超聲提取10 min,以8 500 r/min的速度離心5 min。取5 mL上清液經(jīng)MCX小柱凈化與乙腈沉淀蛋白質(zhì),采用UPLC-HRMS檢測,每一濃度水平平行測定6次,計(jì)算回收率和精密度(RSD)。

圖1 4種化合物質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用正負(fù)離子模式分別對(duì)GLY和AMPA及其同位素內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行一級(jí)掃描,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物在ESI負(fù)離子模式下響應(yīng)更高,準(zhǔn)分子離子峰均為[M-H]-形式。因此,負(fù)離子模式下,確定了GLY、AMPA、1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA的母離子分別為m/z168.006 7、110.001 2、171.010 5和112.001 6。經(jīng)二級(jí)質(zhì)譜圖可知,4種化合物的二級(jí)質(zhì)譜中均含有較高響應(yīng)的碎片m/z62.964 2,選定其為定量離子。為提高檢測靈敏度,分別對(duì)歸一化碰撞能量(normalized collision energy, NCE)、Max IT、AGC和輔助氣溫度(auxiliary gas heated temperature, AUX gas temp)這4種質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見圖1。

由圖1a可知,NCE對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)影響較大,當(dāng)NCE較低時(shí),GLY、AMPA、1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA 4種化合物的質(zhì)譜響應(yīng)較低;隨著NCE增大,質(zhì)譜響應(yīng)顯著增大;當(dāng)NCE達(dá)到一定值后,4種化合物的峰面積基本保持不變。經(jīng)優(yōu)化,分別選擇GLY、AMPA、1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA的NCE值為70、80、70和90。由圖1b可知,Max IT對(duì)4種化合物的質(zhì)譜強(qiáng)度有一定影響,變化趨勢(shì)類似于NCE,先隨Max IT值增大質(zhì)譜響應(yīng)增大,隨后質(zhì)譜響應(yīng)趨于穩(wěn)定。因此,4種化合物的Max IT值均取150 ms。由圖1c可知,AGC對(duì)4種化合物的質(zhì)譜響應(yīng)影響不顯著,后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定AGC的值為2.0×104。AUX gas temp能顯著影響化合物離子化效率,從而影響質(zhì)譜響應(yīng)。由圖1d可知,隨著AUX gas temp值的增大,4種化合物的峰面積逐漸增大;當(dāng)AUX gas temp值為300 ℃時(shí),質(zhì)譜響應(yīng)達(dá)到最大值,繼續(xù)升高AUX gas temp值對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)影響不大?？紤]到節(jié)能和對(duì)儀器的損害最小化等因素,控制AUX gas temp值至300 ℃。

2.1.2液相色譜條件優(yōu)化

圖2 不同流動(dòng)相組成對(duì)GLY色譜行為的影響

分別選擇乙腈-水體系、乙腈-甲酸水溶液(pH=2.0)體系和乙腈-氨水溶液(pH=10.5)體系作為流動(dòng)相,考察其對(duì)GLY和AMPA在Dikma Polyamino HILIC色譜柱上色譜行為的影響,結(jié)果見圖2。當(dāng)采用乙腈-水體系作為流動(dòng)相時(shí),GLY的峰形分叉,且靈敏度較低(見圖2a);當(dāng)采用乙腈-甲酸水溶液體系(pH=2.0)時(shí),峰形較為對(duì)稱,但色譜峰保留較差(GLY的保留時(shí)間tR=1.62 min),且質(zhì)譜響應(yīng)較差(見圖2b);當(dāng)采用乙腈-氨水溶液(pH=10.5)體系作為流動(dòng)相時(shí),GLY色譜峰形較為對(duì)稱,色譜保留較好(tR=4.37 min),且質(zhì)譜響應(yīng)較好(見圖2c)。AMPA在不同流動(dòng)相體系中的色譜行為與GLY相似,因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)均采用乙腈-氨水溶液(pH=10.5)作為流動(dòng)相體系。

可能的原因是:(1)GLY的離子化方式為[M-H]-,堿性條件下能促進(jìn)其離子化,從而提高質(zhì)譜響應(yīng),反之,酸性與中性條件下不利于其離子化過程。(2)GLY分子存在3個(gè)pKa值,分別為分子中羧基(pKa1=2.34)、磷酸基團(tuán)(pKa2=5.73)和氨基正離子(pKa3=10.9)的電離pKa值。當(dāng)流動(dòng)相pH=2.0時(shí)(乙腈-甲酸水溶液(pH=2.0)體系), GLY分子中羧基、磷酸基團(tuán)和氨基正離子均未解離,此時(shí)體系中GLY分子存在形式單一,色譜峰形較為對(duì)稱(見圖2b)。當(dāng)流動(dòng)相2.0

圖3 不同色譜柱對(duì)GLY的色譜行為的影響

如圖3所示,考察了Waters BEH C18、Waters HSS T3和Dikma Polyamino HILIC 3種色譜柱對(duì)GLY和AMPA色譜行為的影響。當(dāng)選擇Waters BEH C18色譜柱時(shí),GLY的峰形極差,拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重(見圖3a)。當(dāng)選擇Waters HSS T3色譜柱時(shí),GLY峰形較窄,對(duì)稱性好,但此時(shí)質(zhì)譜響應(yīng)較差(見圖3b),這是因?yàn)閃aters HSS T3色譜柱耐受pH范圍為2.0～8.0,因此無法使用強(qiáng)堿性流動(dòng)相,從而導(dǎo)致較低的質(zhì)譜響應(yīng)值。當(dāng)選擇Dikma Polyamino HILIC色譜柱時(shí),GLY不僅色譜峰形對(duì)稱、色譜保留佳,而且質(zhì)譜響應(yīng)也較高(見圖3c)。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用Dikma Polyamino HILIC作為色譜分析柱。

圖4 不同固相萃取小柱的凈化效率對(duì)比

2.2 固相萃取柱的選擇與評(píng)價(jià)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11],采用純水能較好地提取樣品中的GLY和AMPA。本文不再對(duì)提取溶劑做過多的優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)過程均采用純水作為提取溶劑。本文重點(diǎn)考察3種固相萃取小柱(PRiME HLB小柱、MCX小柱和GLY專用SPE柱)對(duì)GLY和AMPA的凈化效果的影響,具體實(shí)驗(yàn)過程為:準(zhǔn)確稱取2.00 g面粉與燕麥粉樣品于50 mL離心管中,加入10 mL去離子水,渦旋提取10 min,然后超聲提取10 min,以8 500 r/min的速度離心5 min。取上清液,分別加入GLY、AMPA及其同位素內(nèi)標(biāo)物,使樣品溶液中4種化合物的質(zhì)量濃度為25.0 μg/L,然后分別采用PRiME HLB小柱、MCX小柱和GLY專用柱對(duì)其凈化,通過比較各種固相萃取小柱對(duì)GLY與AMPA的回收率來評(píng)價(jià)凈化效果,結(jié)果如圖4所示。優(yōu)化后3種固相萃取小柱的實(shí)驗(yàn)條件為:采用5 mL甲醇和5 mL水分別對(duì)3種固相萃取小柱進(jìn)行活化與平衡,然后加入5 mL提取液過固相萃取小柱,舍棄前3 mL流出液,取后2 mL流出液。

由圖4a可知,針對(duì)面粉與燕麥中的GLY,經(jīng)水提取與乙腈沉淀蛋白質(zhì)后(未經(jīng)SPE柱優(yōu)化)所得絕對(duì)回收率較低(<60%),而經(jīng)穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)校正后,面粉與燕麥中GLY的相對(duì)回收率有所提升(～80%),但還無法滿足精確定量的要求,由此可見,提取液中存在干擾GLY及其同位素內(nèi)標(biāo)物的共提物,且對(duì)兩者的質(zhì)譜抑制強(qiáng)度不完全一致;經(jīng)水提取與固相萃取小柱凈化后,面粉中GLY的凈化效果普遍比燕麥中好,且3種小柱對(duì)兩種基質(zhì)中GLY的凈化效率排序?yàn)镻RiME HLB小柱>MCX小柱>GLY專用柱。然而經(jīng)同位素內(nèi)標(biāo)物校正后,PRiME HLB小柱的相對(duì)回收率明顯提高,達(dá)到115%～120%; MCX小柱和GLY專用柱的相對(duì)回收率較為理想,分別為95.4%～102%和99.7%～109%,兼顧靈敏度和準(zhǔn)確度的因素(MCX小柱絕對(duì)回收率明顯高于GLY專用柱),最終選擇MCX小柱作為測定面粉和燕麥中GLY的凈化小柱。

由圖4b可知,針對(duì)面粉與燕麥中的AMPA, PRiME HLB小柱和GLY專用柱的凈化能力明顯不足(絕對(duì)回收率<80%)。PRiME HLB小柱對(duì)兩種基質(zhì)中AMPA的絕對(duì)回收率與未經(jīng)SPE凈化的結(jié)果相當(dāng)(均<80%),甚至GLY專用柱對(duì)AMPA的絕對(duì)回收率低于未經(jīng)SPE凈化的結(jié)果。相比之下,MCX小柱對(duì)面粉與燕麥中AMPA的凈化能力最佳,絕對(duì)回收率分別為89.8%和83.8%,經(jīng)同位素內(nèi)標(biāo)物校正后相對(duì)回收率分別為91.1%和82.8%。盡管經(jīng)PRiME HLB和GLY專用柱凈化的相對(duì)回收率尚且理想,但考慮到靈敏度以及與GLY同時(shí)檢測的因素,最終選擇MCX小柱作為測定面粉和燕麥中AMPA的凈化小柱。

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1線性方程和基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

由表2可知,針對(duì)面粉和燕麥樣品中的GLY,未經(jīng)SPE凈化的基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較大,η值分別為-4.19%與-7.02%;經(jīng)MCX小柱凈化后,η值顯著減小,降低至-0.23%與-2.67%。由此可見,MCX小柱凈化能有效降低UPLC-HRMS檢測GLY過程中的基質(zhì)抑制效應(yīng)。針對(duì)面粉和燕麥樣品中的AMPA,經(jīng)MCX小柱凈化后,η值有一定程度減小,由未經(jīng)SPE柱凈化時(shí)的-5.27%與-6.18%降低至-2.29%與-5.38%。隨后,本研究分別采用內(nèi)標(biāo)物1,2-13C215N-GLY和13C15N-AMPA進(jìn)行校正,結(jié)果表明,面粉與燕麥中GLY和AMPA的|η|<3%,檢測過程中基質(zhì)效應(yīng)可以忽略不計(jì)。因此,采用內(nèi)標(biāo)法和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線法能準(zhǔn)確定量檢測面粉和燕麥中GLY和AMPA殘留,且線性相關(guān)系數(shù)>0.999(見表2)。

表2 GLY和AMPA的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)(η)

表3 GLY和AMPA在燕麥和面粉中的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)

2.3.2方法準(zhǔn)確度和精密度

分別稱取2.0 g面粉和燕麥粉空白樣品,然后加入適量標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,配制成低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平(0.1、0.5和2.0 mg/kg),按1.2.5節(jié)進(jìn)行樣品處理,采用UPLC-HRMS檢測,每個(gè)加標(biāo)水平測定6次,結(jié)果見表3。由表3可知,GLY和AMPA在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平均有較好的準(zhǔn)確度和精密度,GLY的加標(biāo)回收率為93.8%～115%, RSDs為2.25%～9.54%; AMPA的加標(biāo)回收率為89.8%～110%, RSD為2.45%～8.71%,能滿足實(shí)驗(yàn)室日常監(jiān)測的要求。

2.3.3方法檢出限與定量限

本研究采用低濃度水平加標(biāo)方式確定方法的檢出限與定量限。分別稱取2.0 g面粉和燕麥空白樣品各3份,分別添加40、100和200 ng GLY和AMPA,使加標(biāo)水平分別為0.02、0.05和0.1 mg/kg,按照1.2.1節(jié)過程處理樣品,然后采用UPLC-HRMS進(jìn)行分析,通過數(shù)據(jù)判斷各低加標(biāo)水平下是否會(huì)出峰,若有出峰,再通過儀器分析軟件計(jì)算信噪比(S/N)。結(jié)果表明,當(dāng)加標(biāo)水平為0.02 mg/kg時(shí)(見圖5a), GLY已出峰,S/N=25,AMPA未出峰;當(dāng)加標(biāo)水平為0.005 mg/kg時(shí),發(fā)現(xiàn)在相同保留時(shí)間處GLY亦有出峰(S/N=5),因此確定GLY的檢出限為0.005 mg/kg,定量限為0.02 mg/kg。當(dāng)加標(biāo)水平達(dá)到0.05 mg/kg時(shí)(見圖5b), AMPA已出峰,軟件計(jì)算S/N=4,確定AMPA的檢出限為0.05 mg/kg,定量限0.1 mg/kg(見圖5c)。與GB/T 23750-2009方法(GLY的LOQ為0.05 mg/kg)相比,本文對(duì)GLY的檢測更靈敏。

圖5 低水平加標(biāo)樣品的平行反應(yīng)監(jiān)測(PRM)色譜圖

2.3.4進(jìn)樣系統(tǒng)殘留控制

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)進(jìn)一針高濃度GLY標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液后,進(jìn)樣系統(tǒng)會(huì)有一定程度的殘留。為使得殘留量降到最小,分別考察了純乙腈、50%乙腈水溶液、純水和0.5%甲酸水溶液作為強(qiáng)洗針液,控制較大體積洗針液體積(2 mL)。結(jié)果表明,0.5%甲酸水溶液作為洗針液時(shí)殘留最少,但仍然無法消除殘留現(xiàn)象,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用0.5%甲酸水溶液作為洗針液。本研究選擇中(50 μg/L)、高(100 μg/L)質(zhì)量濃度GLY標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣(低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣未見明顯殘留),分別通過考察標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白樣品交替進(jìn)樣和進(jìn)一針標(biāo)準(zhǔn)溶液后連續(xù)進(jìn)空白樣品兩種方式計(jì)算GLY殘留水平,以殘留率(%)表示殘留水平。殘留率=純水空白GLY峰面積/前一針標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積×100%,結(jié)果如圖6所示,當(dāng)進(jìn)一針50 μg/L GLY標(biāo)準(zhǔn)溶液后,緊接著進(jìn)一針純水空白,然后繼續(xù)進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣品,如此交替12次試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)GLY的殘留水平穩(wěn)定在3.33%～3.92%之間,RSD為6.04%。當(dāng)只進(jìn)一針50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液后,連續(xù)進(jìn)12針純水空白樣品時(shí),隨著空白進(jìn)樣次數(shù)增多,殘留水平越來越小,且從進(jìn)第2針空白溶液開始,殘留水平降低至約1.0%,基本可以忽略,而進(jìn)完第4針空白樣品后進(jìn)樣系統(tǒng)中GLY已完全消除,進(jìn)樣100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的殘留與消除情況與此類似(見圖6b)。此外,AMPA在進(jìn)樣過程中未發(fā)現(xiàn)明顯的殘留現(xiàn)象。因此,鑒于實(shí)際樣品檢測的實(shí)效性和經(jīng)濟(jì)性,在高濃度樣品進(jìn)樣后,選擇進(jìn)一針空白純水溶液,能有效減小進(jìn)樣系統(tǒng)GLY殘留對(duì)定量檢測結(jié)果的影響。

圖6 進(jìn)樣系統(tǒng)GLY殘留水平試驗(yàn)

2.3.5方法比對(duì)與實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本研究建立的非衍生化測定方法與文獻(xiàn)[10,11]報(bào)道的9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)衍生化方法分別對(duì)弗帕斯(FAPAS)面粉質(zhì)控樣(編號(hào)T09119QC,靶值為0.684 mg/kg,z值表示測定值與真值之間的偏離程度,|z|≤2.0的置信區(qū)間為0.452～0.916 mg/kg)和燕麥能力驗(yàn)證考核樣(編號(hào)09 122,靶值為0.348 mg/kg)中GLY的測定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種方法對(duì)GLY的測定值十分接近(見表4),其中兩種方法對(duì)面粉質(zhì)控樣的測定結(jié)果分別為0.699 mg/kg和0.705 mg/kg,與靶值的相對(duì)偏差分別為2.19%和3.07%;燕麥粉中GLY的方法比對(duì)結(jié)果表明,兩種方法GLY的測定值分別為0.362 mg/kg和0.360 mg/kg,與靶值的相對(duì)偏差分別為4.02%和3.45%,能力驗(yàn)證結(jié)果表明,本方法對(duì)燕麥中GLY的測定結(jié)果滿意(z=0.2, |z|≤2.0即判定合格)。由于FAPAS質(zhì)控樣品和能力驗(yàn)證樣品中均不含AMPA,本研究采用空白面粉與燕麥樣品加標(biāo)回收方式(加標(biāo)水平為0.5 mg/kg)對(duì)AMPA的兩種測定方法進(jìn)行比對(duì)與評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,非衍生化法與FMOC衍生化法測定AMPA的回收率較為理想,分別為99.3%～104%和99.2%～102%。因此,本文建立的非衍生化法能準(zhǔn)確測定面粉與燕麥樣品中GLY和AMPA殘留。應(yīng)用本方法對(duì)市售的10份面粉與燕麥樣品進(jìn)行篩查與檢測,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有GLY與AMPA。

表4 面粉與燕麥中GLY和AMPA的不同分析方法比對(duì)

FMOC: 9-fluorenylmethyl chloroformate; FAPAS: Food Analysis Performance Assessment Scheme.

3 結(jié)論

本文建立了基于UPLC-HRMS的非衍生化法測定面粉與燕麥中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的分析方法,該方法具有簡便、快捷、靈敏和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),適用于實(shí)驗(yàn)室大批量樣品的日常監(jiān)測。