章 豪, 吳銀良, 張宜文, 許秀琴, 徐 峰

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(寧波), 浙江 寧波 315040;2.北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院, 北京 100012)

頭孢類藥物屬于廣譜抗生素,臨診應(yīng)用的頭孢類藥物均為半合成物質(zhì),殺菌力強(qiáng),較青霉素類穩(wěn)定,目前已發(fā)展到第五代[1]。然而過量使用頭孢類藥物會(huì)對(duì)人體健康帶來潛在的危害,對(duì)兒童、老人,特別是胎兒的影響更大,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致胎兒病變、畸形、流產(chǎn)甚至死亡[2,3]。由于細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性和過敏反應(yīng)等原因,目前我國已制定了頭孢類藥物的最高殘留限量:頭孢氨芐在牛肌肉、肝、腎、脂肪和奶中的最高限量分別為200、200、1 000、200和100 μg/kg;頭孢喹肟在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪和牛奶中的最高限量分別為50、100、200、50和20 μg/kg;頭孢噻呋在牛豬肌肉、肝、腎、脂肪、牛奶中的限量分別為100、200、600和200 μg/kg,其中頭孢噻呋的殘留量以其代謝產(chǎn)物呋喃甲酰基頭孢噻呋檢測(cè)含量計(jì)算[4]。但目前頭孢類藥物在蜂產(chǎn)品中暫無限量規(guī)定。

目前對(duì)包括頭孢類藥物在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析的方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[5-18]、高效液相色譜法(HPLC)[19-24]、毛細(xì)管電泳法[25,26]和微生物法[27]。20世紀(jì)90年代以后,絕大多數(shù)生物有機(jī)體中的β-內(nèi)酰胺類藥物殘留分析采用液相色譜進(jìn)行測(cè)定。然而使用液相色譜法測(cè)定時(shí)存在的主要問題是未經(jīng)衍生化測(cè)定時(shí),基體干擾較大;而經(jīng)衍生化測(cè)定后靈敏度雖有所提高,但也只能作為一種篩選方法進(jìn)行使用,對(duì)于分析多種頭孢類藥物仍存在極大難度。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)是一種集多組分定性、定量和高效分離于一體的系統(tǒng),用于分析蜂產(chǎn)品中頭孢類藥物不僅能夠顯著提高方法的靈敏度和定性的準(zhǔn)確度,而且能夠降低前處理的成本和工作量[28]。而不論是采用HPLC還是UPLC-MS/MS方法測(cè)定,通常都采用固相萃取小柱進(jìn)行樣品的凈化和富集[6,8,13]。根據(jù)頭孢類藥物的相關(guān)報(bào)道[29,30],考慮到藥物的理化特性,前處理中凈化一般選用Oasis HLB固相萃取小柱,且凈化過程往往需要活化、淋洗和洗脫等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的步驟。近來,Oasis PRIME HLB固相萃取小柱簡單快速的通過式凈化方案被用于快速有效地去除食品基質(zhì)中的各種主要干擾物,包括脂肪、磷脂以及色素等[28]。Oasis PRIME HLB固相萃取小柱省去傳統(tǒng)的活化、平衡步驟,樣品經(jīng)提取后直接過柱,這種樣品凈化方法簡單、快速、有效,適合大批量日常分析檢測(cè),但目前并未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱用于蜂產(chǎn)品抗生素的樣品前處理。

本研究采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱,通過對(duì)樣品前處理方法和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了基于UPLC-MS/MS測(cè)定3類主要蜂產(chǎn)品(蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉)中頭孢類藥物殘留的分析方法。該方法檢測(cè)周期短,準(zhǔn)確度和精密度高,能滿足多種蜂產(chǎn)品樣品中頭孢類藥物的檢測(cè)需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

UPLC XevoTMTQ-S micro超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(ESI)及MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國Waters公司);低溫高速離心機(jī)(德國Sigma公司); Vortex Genie 3漩渦振蕩器(德國IKA公司)。

頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(頭孢匹林、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢乙腈、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟、去乙?；^孢匹林、頭孢噻肟,純度均大于95%,德國Dr.Ehrenstorfer公司);甲酸(色譜純,美國Tedia公司);乙腈、甲醇(色譜純,德國Merck公司); Oasis PRIME HLB固相萃取小柱(500 mg/6 mL,美國Waters公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取適量(精確至0.1 mg)10種頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用30%(v/v)乙腈水溶液溶解,配制質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃ 保存；分別準(zhǔn)確吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于100 mL容量瓶中,用30%(v/v)乙腈水溶液稀釋,配制質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃保存。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：采用1.2.2節(jié)樣品處理方法制備空白蜂產(chǎn)品樣品溶液,稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2樣品處理

稱取蜂蜜樣品約5.00 g、蜂王漿樣品約2.50 g、蜂王漿凍干粉樣品約1.00 g(精確至0.01 g),分別置于50 mL離心管中,分別加入乙腈-水(80∶20, v/v)溶液20 mL,渦旋振蕩1 min。蜂蜜樣品直接移取溶液,蜂王漿、蜂王漿凍干粉樣品以9 500 r/min高速離心5 min,移取上清液至Oasis PRIME HLB固相萃取小柱,收集全部流出液,流出液在40 ℃下氮?dú)獯蹈?用1 mL 0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇(95∶5, v/v)溶液溶解,渦旋振蕩,過0.22 μm濾膜,用于UPLC-MS/MS分析。

1.2.3色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇;梯度洗脫程序:0～1.0 min, 5%B; 1.0～4.5 min, 5%B～50%B; 4.5～6.0 min, 50%B; 6.0～6.1 min, 50%B～5%B; 6.1～7.5 min, 5%B;流速0.30 mL/min;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件

多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM); ESI源正離子模式電離;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;錐孔氣流速:50 L/h;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;毛細(xì)管電壓:2.0 kV; RF透鏡電壓:0.5 V;萃取錐孔電壓:25 V;頭孢類藥物的相關(guān)參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

基于LC-MS/MS測(cè)定頭孢類藥物殘留大多采用ESI源正離子模式電離的分析方法[5-18]。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水(5∶95, v/v)溶液分別配制10種頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.0 mg/L),利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀自帶的Intellistart軟件分別獲得10種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量(見表1),發(fā)現(xiàn)它們?cè)谡x子模式下均獲得了較好的響應(yīng)。

表1 10種頭孢類藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量

* Quantitative ion.

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈和甲醇作為色譜流動(dòng)相的有機(jī)相時(shí)頭孢類藥物的分離效果,發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用乙腈作為有機(jī)相時(shí),頭孢哌酮、頭孢乙腈等頭孢類藥物的響應(yīng)較差,而采用甲醇作為有機(jī)相時(shí),10種藥物的響應(yīng)均較好,因此確定甲醇為有機(jī)相。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

生物樣品中頭孢類藥物的常用溶劑有甲醇[5]、甲醇-水[9]和乙腈-水[5,6,13]等。因蜂產(chǎn)品特別是蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品中通常含有蛋白質(zhì)和磷脂類物質(zhì),用甲醇或甲醇-水溶解時(shí)樣液較混濁,需進(jìn)一步凈化去除蛋白質(zhì)。而用乙腈溶解時(shí),因蛋白質(zhì)變性沉淀,溶解后雜質(zhì)少,且溶劑澄清,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,目前用于動(dòng)物性食品溶解的乙腈溶液中乙腈含量均高于60%[5,12,19],因此本研究使用乙腈、乙腈-水(80∶20, v/v)和乙腈-水(60∶40, v/v)3種溶劑對(duì)蜂產(chǎn)品在200 μg/kg加標(biāo)水平下進(jìn)行溶解上樣,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-水(60∶40, v/v)上樣時(shí),不能使所有頭孢類藥物的回收率達(dá)到75%以上;而采用乙腈-水(80∶20, v/v)上樣時(shí),所有頭孢類藥物的回收率均大于75%;采用乙腈上樣時(shí),所有頭孢類藥物的回收率大于75%,但考慮到乙腈的強(qiáng)洗脫能力,樣品以及小柱中所含的雜質(zhì)也會(huì)一起被洗脫下來,失去了過柱凈化的目的,因此確定以乙腈-水(80∶20, v/v)進(jìn)行溶解上樣。

2.3 固相萃取小柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)Oasis PRIME HLB和Oasis HLB兩款固相萃取小柱進(jìn)行了比較。我們?cè)诜洚a(chǎn)品中選取最為主要的蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉3類基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn),從每一類基質(zhì)中選取代表樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn),其中,蜂蜜中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種頭孢類藥物的添加水平為4、20、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為1、20、200 μg/kg;蜂王漿中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種藥物的添加水平為8、40、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為2、20、200 μg/kg;蜂王漿凍干粉中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林3種藥物的添加水平為20、50、200 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加水平為5、50、200 μg/kg。結(jié)果表明,樣品采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化后的回收率(75.0%～89.8%)均優(yōu)于采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化的結(jié)果(60.0%～71.0%)。結(jié)果還顯示,在無需活化、淋洗和洗脫等復(fù)雜的步驟下,樣品采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱凈化后,無論是在回收率還是基質(zhì)干擾方面,均優(yōu)于采用Oasis HLB固相萃取小柱凈化的結(jié)果。這可能是因?yàn)閷?duì)于蜂產(chǎn)品特別是蜂王漿和蜂王漿凍干粉中的磷脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),相比Oasis HLB固相萃取小柱,Oasis PRIME HLB固相萃取小柱可以更好地吸附這些雜質(zhì),不僅無需活化、淋洗和洗脫等這些費(fèi)時(shí)費(fèi)力的前處理步驟,在顯著縮短凈化時(shí)間的同時(shí)還能延長色譜柱的使用壽命[31,32]。因此本實(shí)驗(yàn)采用Oasis PRIME HLB固相萃取小柱作為凈化小柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

基質(zhì)效應(yīng)主要是由于樣品在離子化時(shí)基質(zhì)成分與目標(biāo)化合物相互競爭電離所致,包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。在UPLC-MS/MS定性定量分析中,基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對(duì)儀器的靈敏度和重復(fù)性產(chǎn)生影響,進(jìn)而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)采用(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%的計(jì)算方法對(duì)10種頭孢類藥物在蜂產(chǎn)品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行考察。當(dāng)結(jié)果大于100%時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),小于100%時(shí)表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng),結(jié)果越接近100%基質(zhì)效應(yīng)越小。由表2可以看出,蜂產(chǎn)品有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)作用,10種頭孢類藥物均存在不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。為了能更準(zhǔn)確地測(cè)定目標(biāo)化合物,本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來消除基質(zhì)效應(yīng)。采用蜂產(chǎn)品空白基質(zhì)液配制1～1 000 μg/L橫跨3個(gè)數(shù)量級(jí)的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(其中頭孢乙腈、頭孢哌酮和頭孢唑林為5～1 000 μg/L)進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定分析,以峰面積對(duì)相應(yīng)質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2),如表2所示。10種頭孢類藥物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的r2均大于0.999,線性關(guān)系良好。按3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算,10種頭孢類藥物的檢出限(LOD)為0.15～1.5 μg/kg;按S/N=10計(jì)算,10種頭孢類藥物的定量限(LOQ)為0.50～5.0 μg/kg。農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告規(guī)定頭孢喹肟、頭孢氨芐在動(dòng)物性食品中的最大殘留限量為20～1 000 μg/kg,而本方法檢出限低至0.15～1.5 μg/kg,因此能滿足蜂產(chǎn)品中頭孢類藥物含量分析的需要。

表2 10種頭孢類藥物在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

表2 (續(xù))

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率與精密度

選取蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉3類基質(zhì)進(jìn)行添加回收試驗(yàn),計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。頭孢類藥物在蜂蜜空白樣品中的加標(biāo)MRM色譜圖見圖1。蜂蜜中頭孢哌酮、頭孢乙腈和頭孢唑林的添加量為4 μg/kg,其余7種頭孢類藥物的添加量為1 μg/kg,每批次同一水平5個(gè)平行樣品,重復(fù)測(cè)定3次。

由表3可知,10種頭孢類藥物的加標(biāo)回收率為75.0%～89.8%,RSD為1.4%～4.6%。上述結(jié)果表明,該方法對(duì)測(cè)定蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉中10種頭孢類藥物的殘留均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 10種頭孢類藥物在蜂蜜、蜂王漿、蜂王漿凍干粉中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表3 (續(xù))

圖1 蜂蜜加標(biāo)樣品的MRM色譜圖

2.6 方法應(yīng)用

采用優(yōu)化后的儀器條件和前處理?xiàng)l件分別對(duì)隨機(jī)采集的50個(gè)蜂產(chǎn)品(含蜂蜜、蜂王漿和蜂王漿凍干粉)樣品進(jìn)行分析,均未檢出上述10種頭孢類藥物。我們參照GB/T 22942-2008《蜂蜜中頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢喹肟殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了復(fù)測(cè),結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本工作建立了同時(shí)分析蜂產(chǎn)品中10種頭孢類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,樣品經(jīng)乙腈-水(80∶20, v/v)溶液提取后離心,上清液經(jīng)Oasis PRIME HLB固相萃取柱凈化,氮吹后復(fù)溶進(jìn)樣分析。方法具有精密度和準(zhǔn)確度高、檢測(cè)周期短的優(yōu)點(diǎn),能滿足蜂產(chǎn)品中10種頭孢類藥物含量分析的需要。